Sphingobium wenxiniae JZ-1菊酯水解酶（PytH）的晶体结构研究

论文摘要

拟除虫菊酯是一类人工合成的类似天然除虫菊酯的化合物。拟除虫菊酯类农药对鱼类、蜜蜂和水生无脊椎动物等非靶标生物毒性较高；而且,它对哺乳动物的生殖、神经、免疫、内分泌和心血管系统有明显的毒副作用。来源于Sphingobium wenxiniaeJZ-1的菊酯水解酶PytH是一种高效、广谱的拟除虫菊酯降解酶。解析其三维结构,可以使我们从分子水平上理解PytH降解菊酯的机制,为今后利用、改造菊酯类农药、菊酯降解酶及降解菌株提供了重要信息。本研究以质粒pET29a-pytH为模板,PCR扩增出pytH基因,将其克隆至表达载体（pET24b）后,在大肠杆菌中进行高效异源表达,并用Ni2+亲和层析方法纯化表达产物,结果体外可以纯化到大量（20mg每升菌）高纯度的具有生物活性的PytH蛋白。将纯化到的蛋白浓缩至20mg/mL,运用气相扩散方法,成功筛选到两个蛋白结晶条件（114-36:O.lmol/L HEPES Sodium pH7.5, lmol/L Sodium citrate tribasic dihydrate; 110-16:O.1mol/L HEPES Sodium pH7.5,1.5mol/L Lithium sulfate monohydrate）,这两种蛋白结晶条件经优化后,我们分别对野生型蛋白及野生型蛋白与联苯菊酯的复合物进行结晶,获得了PytH野生型蛋白的晶体及其与底物联苯菊酯复合物的晶体,并分别收集到2.81A和2.39A的衍射数据。PytH与已发现的菊酯类水解酶没有任何一致性,NCBI基酸序列比对结果显示其与来自蓖麻的酯酶PIR7B的一致性最高仅约为33%。对结构数据库中的结构的比对结果显示,在PDB数据库中PytH和来源于烟草的水杨酸结合蛋白SABP2 （PDB:1Y7HD）的一致性最高,但仅有21%一致性（截止2013年5月31日）。我们尝试用分子置换的方法解析其结构,但未能成功,因此,为了解析PytH蛋白的晶体结构,我们制备了PytH硒代甲硫氨酸衍生蛋白晶体,并收集到1.96A的衍射数据,运用Se-SAD的方法成功确定了PytH蛋白的相位,并解析了拟除虫菊酯类农药降解酶PytH的晶体结构。PytH与联苯菊酯复合物晶体的空间群为P4（2）2（1）2,每个不对称单元中含有6个PytH单体分子。每个PytH单体分子由14个a螺旋和9个p折叠组成,每两个p折叠之间至少有一个α螺旋,并有若干个平行的α/β结构,这是一个典型的α/β水解酶家族成员。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 引言
• 文献综述
• 1 拟除虫菊酯类农药的危害
• 2 拟除虫菊酯类农药生物降解的研究
• 2.1 拟除虫菊酯类杀虫剂降解菌的研究
• 2.2 拟除虫菊酯类杀虫剂降解酶的研究
• 2.3 Sphingobium wenxiniae JZ-1中的菊酯水解酶（PytH）
• 3 蛋白质晶体学简介
• 3.1 高质量蛋白质晶体的获得
• 3.1.1 蛋白质晶体的生长
• 3.1.2 蛋白质晶体质量的提高
• 3.2 相位的测定
• 第一章 菊酯水解酶PytH基因的表达、蛋白纯化、酶活性的检测及稳定性研究
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 质粒及宿主菌
• 1.1.2 引物
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 酶和试剂
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 pytH基因的扩增与纯化
• 1.2.2 重组质粒pET24b-pytH的构建
• 1.2.3 重组质粒pET24b-pytH在大肠杆菌中的诱导表达
• 1.2.4 菊酯水解酶PytH蛋白表达条件的优化
• 1.2.5 菊酯水解酶PytH的纯化
• 1.2.6 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）
• 1.2.7 菊酯水解酶PytH活性的检测
• 1.2.8 PytH稳定性的初步研究
• 1.2.9 不同纯化方法对PytH蛋白稳定性影响的研究
• 1.2.10 金属离子对PytH稳定性影响的研究
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 pytH基因的获得
• 1.3.2 重组质粒的构建
• 1.3.3 菊酯水解酶PytH在大肠杆菌中的诱导表达
• 1.3.4 PytH表达条件的优化
• 1.3.5 菊酯水解酶PytH的纯化
• 1.3.6 菊酯水解酶PytH活性的检测
• 1.3.7 PytH稳定性的初步研究
• 1.3.8 不同纯化方法对PytH蛋白稳定性影响的研究
• 1.3.9 金属离子对PytH稳定性影响的研究
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第二章 菊酯水解酶PytH晶体结构的解析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 表达宿主菌
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PytH蛋白的大量纯化
• 2.2.2 PytH蛋白结晶条件的初步筛选
• 2.2.3 PytH蛋白晶体的初步鉴定
• 2.2.4 硒代甲硫氨酸PytH蛋白的纯化与结晶
• 2.2.5 PytH蛋白结晶条件的优化
• 2.2.6 PytH蛋白与底物共结晶
• 2.2.7 PytH蛋白晶体衍射能力的检查及衍射数据采集
• 2.2.8 PytH蛋白晶体的结构解析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 PytH蛋白的大量纯化
• 2.3.2 蛋白质晶体生长以及晶体的初步检查
• 2.3.3 硒代甲硫氨酸PytH蛋白的纯化
• 2.3.4 PytH蛋白结晶条件的优化及晶体衍射结果
• 2.3.5 PytH蛋白晶体结构的解析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢