小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性及致病性缺陷菌株的回复突变检测

论文摘要

由镰刀菌引起的赤霉病是危害多种粮食作物的一种重要病害，广泛分布于世界温暖潮湿地区。赤霉病不仅造成产量损失，而且产生的真菌毒素严重威胁人畜健康。在我国，禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum Schwabe）是小麦赤霉病的主要致病菌种，其有性阶段为玉蜀黍赤霉菌（Gibberella zeae）。近年来，华东地区的小麦赤霉病菌已经对多菌灵产生了抗药性，增加了小麦赤霉病防治的难度。为进一步了解国内其它地区的小麦赤霉对多菌灵的抗药性情况，我们从黑龙江、吉林和河南等8个省市采集了小麦赤霉病55个样本进行多菌灵敏感性实验。并对小麦赤霉病菌致病缺陷性突变菌株进行了回复突变检测，建立了一套回复突变检测体系。1．小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性从黑龙江、吉林、上海、河南、陕西、北京、湖北和四川等不同地区的小麦病穗上单孢分离得到55株小麦赤霉病菌菌株。对55株小麦赤霉病菌中31株代表菌株的保守基因EF-1-alpha基因PCR扩增并测序的结果显示，除两株从吉林地区分离出来的菌株是F.acuminatum外，其余29株均为禾谷镰刀菌（F.graminearum）。应用菌丝生长速率法测定各菌株对多菌灵的抗药水平，结果发现：所测不同菌株对多菌灵的抗性水平同属敏感型，但菌株间有一定差异，EC50值在0.3241～2.1055μg／mL之间，产孢量在菌株间有显著差异。以上结果说明黑龙江、吉林、河南和湖北等地田间采集的小麦赤霉病菌样本在离体培养条件下均对多菌灵敏感，这个结论给多菌灵使用的安全性提供了一定的理论依据。2．小麦赤霉病菌致病力缺陷菌株的回复突变本试验是在美国普尔度大学植物与植物病理系许景荣博士课题组已构建的小麦赤霉病菌FST7基因缺失突变菌株（fst7）的基础上进行的，已初步确定FST7基因与小麦赤霉病菌致病过程相关。为进一步了解小麦赤霉病菌FST7基因的功能，本试验利用PEG／原生质体介导的方法将野生型FST7基因成功导入突变菌株（fst7），构建了回复突变菌株，并通过PCR方法验证了其基因型。经过3代以上的继代培养后转化子仍具有G418抗性，说明抗性标记在回复突变菌株的染色体内稳定遗传。各项表型试验表明回复突变转化子菌株与野生型菌株表型相似。通过小麦胚芽鞘的侵染实验证明缺失突变菌株fst7的致病性低于野生型菌株，回复突变菌株的致病性恢复到野生型菌株的水平，FST7基因在小麦赤霉病菌致病过程中起重要作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 小麦赤霉病研究进展
• 1.1 小麦赤霉病的危害
• 1.2 小麦赤霉病的症状
• 1.3 小麦赤霉病的病原
• 1.4 小麦赤霉病的病害循环
• 1.5 小麦赤霉病的防治
• 2 小麦赤霉毒素的生物学和毒理学
• 2.1 毒素的污染
• 2.2 毒素在小麦赤霉病发生过程中的作用
• 3 小麦赤霉病菌功能基因的研究
• 4 小麦赤霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性
• 4.1 研究进展
• 4.2 苯并咪唑类杀菌剂的作用机制
• 4.3 小麦赤霉病对苯并咪唑类杀菌剂抗性机制
• 5 丝状真菌的转化
• 5.1 研究概况
• 5.2 原生质体转化技术
• 5.3 赤霉菌的遗传转化
• 5.4 转化中的选择标记
• 第二章 小麦赤霉病菌的分离、鉴定及多菌灵敏感性研究
• 1 试验材料
• 1.1 供试药剂
• 1.2 供试菌株
• 2 试验方法
• 2.1 小麦赤霉病菌的单孢分离
• 2.1.1 小麦赤霉病菌的分离
• 2.1.2 小麦赤霉病菌的单孢纯化
• 2.2 小麦赤霉病菌的分子鉴定
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 分子鉴定
• 2.3 小麦赤霉病菌对多菌灵的敏感性测定
• 2.4 不同地区小麦赤霉病菌产孢量的比较
• 3 试验结果
• 3.1 小麦赤霉菌菌株的分离
• 3.2 分子鉴定结果
• 3.3 小麦赤霉病菌多菌灵的敏感性
• 3.4 产孢量的比较
• 4 结论与讨论
• 第三章 回复突变试验
• 1 试验材料
• 1.1 菌株及载体
• 1.2 培养基及溶液
• 2 试验方法
• 2.1 细菌转化和质粒提取
• 2.1.1 细菌转化
• 2.1.2 质粒提取
• 2.2 载体构建
• 2.2.1 目的片断的获得
• 2.2.2 质粒载体的构建
• 2.2.3 酶切鉴定
• 2.3 原生质体的制备
• 2.3.1 菌丝体的收集
• 2.3.2 原生质体制备
• 2.4 原生质体转化
• 2.4.1 原生质体转化
• 2.4.2 G418抗性筛选及稳定性测试
• 2.4.3 PCR验证
• 2.5 转化子的表型分析
• 2.5.1 生长速率的比较
• 2.5.2 产孢量测定
• 2.6 转化子致病力的测定
• 2.6.1 试验材料
• 2.6.2 方法
• 2.7 转化子对多菌灵的敏感性试验
• 3 试验结果
• 3.1 载体构建
• 3.1.1 目的片断的获得
• 3.1.2 p7G质粒验证
• 3.2 fst7菌株原生质体的制备
• 3.3 G418抗性筛选及稳定性测试
• 3.3.1 G418抗性筛选
• 3.3.2 转化子稳定性测试
• 3.3.3 PCR验证
• 3.4 转化子的表型分析
• 3.4.1 菌丝和孢子形态
• 3.4.2 产孢量
• 3.5 转化子致病性测定
• 3.6 转化子对多菌灵（MBC）的敏感性
• 4 结论与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文目录