论文摘要
乙酰化是一种可逆且高度调控的蛋白质翻译后修饰,主要发生于蛋白质赖氨酸残基的ε-NH2位,它调控细胞凋亡、亚细胞的定位、DNA和蛋白质相互作用、DNA复制和修复、DNA转录的活性及蛋白质的稳定性等蛋白质相关过程。赖氨酸的乙酰化修饰和调控其发生的酶与生命的老化过程及一些重大的疾病如癌症,心血管疾病存在着密切的联系,由此蛋白质乙酰化翻译后修饰的鉴定具有重要的生物学意义。传统乙酰化蛋白鉴定的方法有放射性检测和免疫亲和检测,但是这些方法都仅能检测到乙酰化蛋白的存在,不能得到具体的乙酰化修饰位点信息。软电离生物质谱技术ESI-MS和MALDI-MS能很好地应用于翻译后修饰的鉴定研究,不仅能检测到翻译后修饰蛋白,且能得到具体的修饰位点信息。本论文的研究工作旨在考察两类生物质谱技术ESI-MS和MALDI-MS在乙酰化蛋白质翻译后修饰鉴定中的应用及其应用于小鼠肝乙酰化修饰谱的鉴定研究。本论文的第一章主要对蛋白质组学中翻译后修饰的研究发展,各种翻译后修饰的鉴定研究策略,乙酰化翻译后修饰研究进展进行了概述。本文的研究工作主要分为两个部分,分别在第二章和第三章中作了详细介绍。第二章的研究中,利用两类生物质谱技术ESI-MS（LC-IT-TOF质谱仪,LTQ-Orbitrap质谱仪）和MALDI-MS（4700 Proteomics Analyzer质谱仪,QIT质谱仪）,对乙酰化标准蛋白乙酰化BSA进行质谱鉴定研究,为小鼠肝乙酰化蛋白质修饰谱的鉴定研究提供方法学的参考。实验表明,LC-ESI-MS（LTQ-Orbitrap）和MALDI-TOF-TOF（4700 proteomic analyzer）两种方法鉴定乙酰化蛋白较另外两种质谱方法优越,且这两种方法在乙酰化后修饰鉴定上具有互补的特性。在第三章的研究中,我们根据第二章的研究设计了两条小鼠肝乙酰化蛋白的鉴定研究路线,其一为利用成熟的蛋白质分离技术二维凝胶电泳（2DE）分离鼠肝全蛋白,采用生物医学研究院赵世明老师提供的赖氨酸乙酰化抗体进行2D Western-Blotting验证,将Western-Blotting免疫印迹分析中呈阳性反应的点比对到2DE凝胶,并将筛选到的蛋白点切胶酶解,用4700 Proteomics Analyzer质谱仪鉴定分析,鉴定到6个赖氨酸乙酰化蛋白,8个赖氨酸乙酰化修饰位点。其二为利用免疫沉淀技术富集小鼠肝全蛋白中的乙酰化蛋白,用LTQ-Orbitrap质谱仪分析鉴定,鉴定到91个赖氨酸乙酰化蛋白,216个赖氨酸乙酰化修饰位点。在鉴定到的97个乙酰化蛋白中,大部分未有被文献报道过。我们对鉴定到的蛋白进行了生物功能、生理过程、亚细胞定位的分类。此外,我们用Q-Star飞行时间质谱仪（ESI源）进行了小鼠肝中苏氨酸和丝氨酸上的乙酰化蛋白翻译后修饰鉴定,鉴定了18个苏氨酸乙酰化翻译后修饰蛋白,21个苏氨酸乙酰化修饰位点,25个丝氨酸乙酰化修饰蛋白,30个丝氨酸乙酰化修饰位点,极大地补充了数据。本论文的第四章对乙酰化翻译后修饰的发展做了总结,对本论文的研究工作进行了展望。本研究为首次结合两类生物质谱技术对小鼠鼠肝样品进行大规模的乙酰化蛋白修饰谱鉴定分析,为后续的乙酰化蛋白功能分析及其与重大疾病和癌症的相关性研究提供了很好的数据库参考。