论文题目: 与氰戊菊酯抗性相关的棉铃虫细胞色素P450基因的克隆及异源表达
论文类型: 博士论文
论文专业: 农业昆虫与害虫防治
作者: 陈松
导师: 吴益东
关键词: 棉铃虫,抗药性,氰戊菊酯,细胞色素氧化酶,过量表达,半定量,酵母异源表达
文献来源: 南京农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 一、氧化解毒代谢增强在棉铃虫对氰戊菊酯抗性中的作用 将2001年采自山东省阳谷县的棉铃虫田间种群分为3个亚种群:对其中一个亚种群用氰戊菊酯筛选13代获得YGF抗性品系;对另一个亚种群用氰戊菊酯+PBO筛选13代获得YGFP抗性品系;第三个亚种群在不接触任何药剂的条件下同步饲养,作为对照品系(YG)。与标准敏感品系(SCD)相比,YG品系对氰戊菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯的抗性分别7、14、14、15倍,YGF抗性品系对它们的抗性分别为1630、535、72和160倍,YGFP抗性品系对它们的抗性分别为2420、2898、282、729倍。 在YGF品系中,PBO对氰戊菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯和功夫菊酯的增效比分别为458、53、4和5倍,而DEF对它们的增效比分别为4、3、0.8和0.8倍。在YGFP品系中,PBO对氰戊菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯和功夫菊酯的增效比分别为12、46、16和22倍,而DEF对它们的增效比分别为11、2、3和9倍。该结果表明,氧化酶解毒代谢增强在YGF和YGYP两个抗性品系对拟除虫菊酯的抗性中均起主要作用,酯酶解毒代谢也参与其中。 为了进一步明确氧化解毒代谢增强在YGF和YGYP品系对拟除虫菊酯抗性的作用,进行了解毒代谢酶活性的研究。YGF品系和YGFP品系四龄末期幼虫的细胞色素P450氧化酶O-脱甲基活性(以对硝基苯甲醚为底物,PNOD)分别为SCD敏感品系的23.1和9.3倍。YGF品系和YGFP品系三龄幼虫的酯酶活性(以α-乙酸萘酯为底物)分别为SCD敏感品系的2.4、1.1倍,谷胱甘肽转移酶活性(以CDNB为底物)分别为SCD敏感品系的1.3、1.8倍。解毒酶活性的结果与增效剂增效作用的结果是一
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符号及缩略语等的说明
第一章 文献综述
1．棉铃虫对拟除虫菊酯抗性概况
1．1 中国
1．2 印度
1．3 巴基斯坦
1．4 澳大利亚
1．5 西非
2．棉铃虫对拟除虫菊酯的抗性机理
2．1 表皮穿透下降
2．2 神经不敏感性
2．3 解毒代谢增强
3．细胞色素P450的结构与功能
3．1 细胞色素P450特征及催化机理
3．2 细胞色素P450氧化酶晶体结构
3．3 昆虫细胞色素P450基因的转录调控机制
4．昆虫细胞色素P450基因的过量表达与抗药性
4．1 CYP6D1
4．2 CYP6A1
4．3 CYP6G1
5．昆虫细胞色素P450的异源功能表达
5．1 大肠杆菌表达系统
5．2 酵母表达系统
5．3 杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统
第二章 氧化代谢增强在棉铃虫对氰戊菊酯抗性中的作用
1．材料与方法
1．1 供试昆虫
1．2 供试药剂
1．3 生物测定方法
1．4 细胞色素P450氧化酶活性测定
1．5 酯酶活性测定
1．6 谷胱甘肽转移酶活性测定
1．7 蛋白质含量测定
1．8 数据统计分析
2．结果与分析
2．1 八种常用杀虫剂对棉铃虫敏感品系(SCD)的毒力测定
2．2 YGF和YGFP品系对拟除虫菊酯的交互抗性
2．3 增效剂增效作用测定
2．4 细胞色素P450氧化酶、酯酶及谷胱甘肽转移酶活性测定
3．讨论
3．1 YGF和YGFP品系抗性机理
3．2 增效剂PBO应用于田间防治害虫
第三章 棉铃虫细胞色素P450O-脱甲基活性与对氰戊菊酯抗性的关系
1．材料与方法
1．1 供试昆虫
1．2 供试药剂
1．3 生物测定方法
1．4 不同增溶剂存在条件下细胞色素P450氧化酶PNOD活性测定
1．5 细胞色素P450氧化酶PNOD活性测定
1．6 数据统计分析
2．结果与分析
2．1 六种增溶剂的增溶效果比较
2．2 不同棉铃虫品系对氰戊菊酯抗性水平与细胞色素P450氧化酶PNOD活性相关性分析
3．讨论
3．1 增溶剂在细胞色素P450氧化酶PNOD活性测定中的作用
3．2 棉铃虫细胞色素P450氧化酶PNOD活性与棉铃虫生化检测
第四章 棉铃虫细胞色素P450基因克隆及mRNA差异表达
1．材料与方法
1．1 供试昆虫
1．2 总RNA提取及cDNA第一链合成
1．2．1 棉铃虫脂肪体总RNA提取
1．2．2 琼脂糖凝胶检测总RNA
1．2．3 cDNA第一链合成
1．3 引物设计及PCR扩增细胞色素P450 cDNA片段、克隆、测序
1．4 采用RACE策略克隆细胞色素P450基因全长
1．5 半定量PCR检测细胞色素P450基冈mRNA在脂肪体的表达量
1．5．1 cDNA第一链合成
1．5．2 半定量PCR
1．5．3 细胞色素P450基因mRNA表达量定量分析
1．6 引物设计及序列分析软件
1．7 棉铃虫细胞色素P450新基因注册
2．结果与分析
2．1 三个新细胞色素P450基因序列分析
2．2 翻译的氨基酸序列分析
2．3 半定量PCR分析
3．讨论
第五章 棉铃虫细胞色素P450基因异源表达
1．材料与方法
1．1 供试昆虫
1．2 化学试剂
1．3 棉铃虫、酵母总RNA提取及cDNA第一链合成
1．3．1 PCR扩增CYP9A12和CYP9A14全长基因
1．3．2 CYP9A12、CYP9A14mRNA在酵母诱导培养中的表达
1．4 PCR产物纯化
1．5 双酶切酵母表达质粒、CYP9A12和CYP9A14
1．6 连接反应
1．7 转化大肠杆菌、扩大培养
1．8 质粒提取及BamHⅠ、EcoRⅠ酶切检测
1．9 质粒DNA双向测序验证
1．10 酵母菌株及培养
1．11 转化酵母细胞
1．12 诱导外源基因表达
1．13 酵母微粒体提取
1．14 不同诱导时段外源基因表达的检测
1．14．1 酵母培养
1．14．2 SDS-PAGE电泳检测表达的蛋白
1．15 酵母微粒体PNOD、ECOD及MROD活性测定
1．16 溴氰菊酯的离体代谢
1．17 数据统计分析
2．结果与分析
2．1 PCR检测外源细胞色素P450基因mRNA表达
2．2 SDS-PAGE检测表达的蛋白
2．2．1 CYP9A14在半乳糖不同时段诱导表达
2．2．2 半乳糖诱导16小时外源基因在酵母中的表达
2．3 重组酵母微粒体细胞色素P450氧化酶活性测定
2．4 溴氰菊酯的离体代谢作用
3．讨论
全文总结
参考文献
附录：攻读学位期间发表的学术论文
致谢
发布时间: 2005-07-19
参考文献
- [1].拟除虫菊酯与有机磷农药的联合毒性与毒理学机制研究[D]. 王心如.南京农业大学2000
- [2].薄荷上3种农药用药风险评估及加工过程中残留转移规律研究[D]. 徐彦军.中国农业大学2014
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