云南番茄双生病毒鉴定及烟草曲茎病毒致病分子机理研究

论文题目: 云南番茄双生病毒鉴定及烟草曲茎病毒致病分子机理研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 李正和

导师: 周雪平

关键词: 双生病毒,番茄,烟草曲茎病毒,致病机理,卫星

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的植物单链DNA病毒,目前已在多个国家和地区的作物上造成毁灭性危害。近年来,我国华南各省作物上双生病毒病害的发生有逐年加重的趋势。本文对云南番茄上的双生病毒类群以及烟草曲茎病毒(TbCSV)的致病分子机理进行了研究。从云南省采集了23个的番茄曲叶病的样品,TAS-ELISA和部分序列分析发现它们属于不同的种类。测定了四个分离物(Y25、Y41、Y72和Y161)的全序列,同源性比较和进化分析表明,Y25、Y41、Y72和Y161分别属于四种不同的病毒,即中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)、TbCSV、泰国番茄黄化曲叶病毒(TYLCTHV)以及云南烟草曲叶病毒(TbLCYNV)。所有TYLCCNV和TYLCTHV的分离物都发现伴随有卫星DNAβ分子,而属于TbCSV和TbLCYNV的几个分离物都没有检测到卫星的存在。测定了Y25、Y72、Y77和Y79伴随的DNAp的全序列,比较发现,Y25p与其它TYLCCNV分离物伴随的卫星紧密相关,而Y72β、Y77β和Y79β属于一类新的卫星分子,与TbCSV卫星的同源性最高。田间调查发现,在42个TbCSV侵染的样品中,仅13个分离物伴随有卫星分子。对其中一个伴随DNAB的分离物(TbCSV-Y35)进行的致病性分析表明,TbCSV-Y35单独能够在本氏烟和自然寄主普通烟上产生严重的上卷症状,且子代病毒能够被烟粉虱传播,表明TbCSV-Y35单独能够在田间维持病害的发生。当与卫星共同接种时,TbCSV-Y35能够在其烟属(Nicotiana)寄主上产生更为严重的下卷症状。然而在番茄寄主上,卫星对于TbCSV-Y35诱导的症状没有影响,且辅助病毒不能稳定的维持卫星的存在。与其它双生病毒/DNAβ病害复合体不同,卫星对于TbCSV-Y35的核酸积累、侵染效率、发病时间和寄主范围都没有影响。对另一个不伴随卫星的分离物(TbCSV-Y1)进行研究发现,TbCSV-Y1能引起和TbCSV-Y35相似的症状,且能与DNAp进行功能性的互作。这些结果表明,TbCSV DNAβ并非辅助病毒系统侵染所必需的,但能以寄主专化性的方式加重病害的症状。利用Overlap Extension PCR的方法,将TbCSV-Y35 C4 ORF上2422和2440

论文目录:

致谢

摘要

Abstract

缩略语表

第一章文献综述

引言

1.双生病毒的分类、命名与进化

1.1 双生病毒的分类历史与现状

1.1.1 Mastrevirus

1.1.2 Curtovirus

1.1.3 Topocuvirus

1.1.4 Begomovirus

1.2 双生病毒种的划分

1.2.1 病毒种的定义

1.2.2 双生病毒种的划分标准

1.2.3 双生病毒各分类标准在分类中的作用及局限性

1.3 双生病毒的命名与书写规则

1.4 双生病毒的进化

2.双生病毒病害复合体是一类新的致病类型

2.1 双生病毒伴随的类似Nanovirus的DNA1分子

2.2 双生病毒伴随新型的卫星分子——DNAβ

2.3 双生病毒病害复合体的起源与进化

2.4 双生病毒病害复合体是作物生产上的潜在威胁

3.双生病毒致病的分子机理

3.1 双生病毒的基因组结构

3.2 双生病毒的运动

3.2.1 双组份双生病毒的运动

3.2.2 单组份双生病毒的运动

3.3 双生病毒的致病相关因子

3.3.1 C4

3.3.2 C2／AC2

3.3.3 BC1

3.3.4 BV1

3.3.5 卫星DNAβ编码的βC1

3.4 双生病毒与RNA沉默

3.5 结语

第二章材料与方法

1 材料

1.1 植物材料

1.2 病毒侵染性克隆

1.3 菌株和质粒

1.4 试剂

1.5 常用缓冲液的配制

2 方法

2.1 PCR技术

2.2 PCR产物纯化

2.3 DNA克隆技术

2.4 重组质粒的提取与鉴定

2.5 植物总DNA提取和Southern分析

第三章云南省番茄曲叶病病原鉴定

1 材料

1.1 毒源

1.2 抗血清

2 方法

2.1 三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)测定

2.2 植物总DNA提取

2.3 病毒基因组DNA克隆及序列测定

2.4 序列分析

3 结果与分析

3.1 症状观察及抗原表位谱(epitope profile)测定

3.2 DNAA基因组结构

3.3 DNAA同源性比较

3.4 DNAB组份的检测

3.5 卫星DNAβ的检测、克隆与分析

4 讨论

第四章烟草曲茎病毒及伴随的DNAβ的致病性研究

1 材料与方法

1.1 毒源和植物总DNA提取

1.2 田间样品的PCR检测

1.3 TbCSV与DNAβ的侵染性克隆构建

1.4 农杆菌介导的植株接种

1.5 病毒的Southem印迹检测

1.6 粉虱传毒试验

2 结果与分析

2.1 仅部分TbCSV田间分离物伴随DNAβ

2.2 TbCSV-Y35单独侵染可以诱导严重症状

2.3 DNAβ不影响TbCSV-Y35的寄主范围

2.4 DNAβ不影响TbCSV-Y35的核酸积累及侵染效率

2.5 DNAβ对TbCSV-Y35在番茄上的致病性没有影响

2.6 TbCSV-Y35单独可以完成生活史

2.7 TbCSV-Y1可以与TbCSVDNAβ互作

3 讨论

第五章烟草曲茎病毒C4 ORF的突变分析

1 材料与方法

1.1 病毒

1.2 TbCSV-Y35 C4突变体构建

1.3 TbCSV-Y35 C4突变体的侵染性克隆构建

1.4 农杆菌接种

1.5 本氏烟叶盘法检测病毒的复制

1.6 Southern印迹杂交

2 结果与分析

2.1 TbCSV-Y35 C4突变体的构建与鉴定

2.2 TbCSV-Y35 C4突变体的致病性分析

2.3 TbCSV-Y35 C4突变体在本氏烟植株中的积累分析

2.4 TbCSV-Y35 C4突变体在本氏烟叶盘中的积累分析

3 讨论

第六章 TbCSV与TYLCCNV病害复合体症状差异的遗传决定因子定位

1 材料与方法

1.1 病毒

1.2 TbCSV-Y35 DNAβ βC1无义突变体构建

1.3 TbCSV-Y35 DNAβ与TYLCCNV-Y10 DNAβ βC1置换的嵌合体卫星构建

1.4 DNAB侵染性克隆构建

1.5 农杆菌接种及假重组(Pseudorecombination)实验

1.6 Southern印迹检测

2 结果与分析

2.1 Y35β C1 ORF突变分析

2.2 TbCSV-Y35与TYLCCN-Y10假重组实验

2.3 嵌合体卫星诱导的症状类型分析

2.4 TYLCCNV其它分离物伴随卫星的致病性分析

3 讨论

附小麦矮缩病毒侵染性克隆构建及致病性研究

1 材料与方法

1.1 毒源和植物总DNA提取

1.2 WDV-Wz-1和WDV-Ge-H012全序列测定和侵染性克隆构建

1.3 农杆菌介导的植株接种

1.4 叶蝉传毒试验

1.5 Multiplex PCR体系的建立

1.6 序列分析

2 结果与分析

2.1 基因组结构与同源性比较分析

2.2 侵染性测定和寄主范围分析

2.3 Multiplex PCR体系的建立及田间复合侵染检测

3 讨论

参考文献

附录A 常用生化及分子生物学试剂与仪器

附录B 常用缓冲液及培养基配方

发布时间: 2005-07-22

参考文献

[1].福建省begomoviruses的检测和分子生物学研究[D]. Muhammad Arif.福建农林大学2018
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[4].广西杂草双生病毒的分子鉴定[D]. 黄家风.浙江大学2005
[5].海南杂草双生病毒的分子鉴定及病毒致病性研究[D]. 熊庆.浙江大学2005
[6].双生病毒卫星DNA的βC1基因缺失突变体的致病性及稳定性测定和缺失突变体的利用[D]. 钱亚娟.浙江大学2005
[7].四种双生病毒的分子鉴定[D]. 郭小建.浙江大学2006
[8].广西双生病毒的分子鉴定[D]. 徐幼平.浙江大学2006
[9].三种双生病毒及其伴随卫星DNA的致病性研究[D]. 郭维.浙江大学2008
[10].我国五种双生病毒的分子鉴定及致病性研究[D]. 吴剑丙.浙江大学2008

云南番茄双生病毒鉴定及烟草曲茎病毒致病分子机理研究

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