混合物中多种噻唑烷酮类小分子探针的构效关系及协同作用研究

论文摘要

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在全球范围内居恶性肿瘤之首。尽管目前抗癌药物的抗癌疗效已有很大进步,但是肺癌病人的五年存活率只有15%,居于末位,其中85%以上的肺癌源于非小细胞肺癌。靶向治疗已成为当前肺癌研究的热点,然而由于肿瘤的发生、发展和成因非常复杂,单一的分子靶向治疗逐渐显现其弊端,多层次、多靶点治疗的系统生物学越来越受到人们的关注。组合化学与高通量筛选方法的兴起加速了抗肿瘤药物的合成与筛选速度,是药物开发领域中的重要革新。噻唑烷酮类化合物是一类重要的杂环化合物,不仅可以选择性抑制肿瘤细胞的生长,又能有效抑制抗药性的肿瘤细胞,是一种极具潜力的抗肿瘤药物。本实验室利用组合化学方法设计并合成了一个包含170种化合物的噻唑烷酮类小分子化合物库,并通过传统的生物活性筛选方法,即对单个小分子探针逐一进行筛选,确定了10种对非小细胞肺癌细胞系有活性的化合物。鉴于传统药物筛选方法不能够充分利用组合化学中特殊的化合物结构信息,本论文提出了针对组合化学化合物库的新型筛选方法,该法将化合物混合后进行筛选,通过分析筛选结果确定活性基团,并最终发现有活性的小分子化合物。这种筛选方法可以更充分地利用组合化学的独特的化合物结构信息来分析化合物的构-效关系。研究内容:1、通过研究噻唑烷酮类化合物的混合物对非小细胞肺癌细胞系的抑制情况,分析运用该方法筛选抗肿瘤药物的可行性;2、分析混合物中小分子探针间的相互作用及其对混合物的抗癌活性的影响;3、通过对噻唑烷酮化合物库中化合物混合物的体外筛选,发现抗癌活性强的混合物,以用于多靶点药物的研究与开发;4、通过对噻唑烷酮类小分子化合物抑制P-糖蛋白作用的研究,对该类化合物的药物作用靶点进行初步探索。研究方法:根据组合化学理论与已获得的化合物的筛选数据,对已合成的化合物库中化合物进行挑选、分组,选取了98种化合物,按照结构与活性关系将4个化合物等体积混合,构成100种混合物,并将混合物按照活性化合物个数不同分为5组,进行以下研究:1、混合物作用于紫杉醇敏感型肺癌细胞H460及紫杉醇耐药型肺癌细胞H460/taxR24小时后观察细胞形态变化情况,初步确定混合物对细胞增殖情况的影响。2、利用SRB方法检测两种非小细胞肺癌细胞经混合物处理72小时后的存活率,分析确定可能的药物活性基团。3、选择对肺癌细胞抑制作用强的混合物,利用SRB检测方法对人正常成纤维细胞NHFB进行筛选。4、选取对肺癌细胞抑制作用强的混合物进行浓度依赖性实验,计算GI50值并与组成该混合物的单个化合物的GI50值比较。5、根据药效团模型的结果,从化合物库中选取3种符合P糖蛋白抑制剂、但不符合P-糖蛋白底物条件的小分子探针,研究其对P-糖蛋白的抑制作用。研究结果:1、通过在显微镜下观察混合物对两种非小细胞肺癌细胞系H460细胞和H460/taxR细胞的处理效果,我们发现各组混合物对细胞增殖的抑制作用差别较大,与对照组比较,经4个活性化合物组成的混合物处理组细胞增殖最少,经4个非活性化合物组成的混合物处理组细胞增殖最多。2、通过SRB检测,获得了100种混合物分别作用于H460细胞和H460/taxR细胞72h后的细胞增殖率。以H460细胞为筛选模型的结果显示,经4个活性化合物组成的混合物处理的细胞平均增殖率为19%;经4个非活性化合物组成的混合物处理的细胞平均增殖率为65%;分别由1个活性化合物与其它3个非活性化合物组成的混合物处理组细胞的平均增殖率为42%;以H460/taxR细胞为筛选模型的结果显示,经4个活性化合物成的混合物处理的细胞平均增殖率为5%,经4个非活性化合物组成的混合物处理的细胞平均增殖率为为72%,分别由1个活性化合物与其它3个非活性化合物组成的混合物处理组细胞的平均增殖率为35%。3、选择两种对肿瘤细胞抑制作用较强的混合物m56和m91与相应的单个化合物进行半抑制率GI50值的测定并进行比较,发现m56的GI50值与活性最强的化合物284的GI50值最为接近;m91的GI50值与四种组合化合物中活性最弱的化合物264最为接近。其中,m56为187、284、264和344号化合物的等体积混合物m91为38、45、264和274号化合物的等体积混合物。4、化合物库中25、27和48号化合物与紫杉醇混合后,并没有改变紫杉醇单独作用时对药物敏感型肺癌细胞系H460的抑制作用,但是对P-糖蛋白过表达的肺癌细胞系H460/taxR抑制作用明显增强,使H460/taxR细胞的增殖率降低了20%左右。结论:1、通过分析实验结果,将细胞增殖率按照从小到大进行排序,选取对细胞抑制作用较强,即细胞增殖率较小的50个混合物进行分析,统计了化合物中各主要基团出现的频率,根据频率大小分析出可能的活性基团,并由分析得到的活性基团推测出有抗癌活性的化合物。将混合物方法分析出的活性化合物与已报道的单个化合物筛选得到的结果比较,结论基本一致,从而证明了体外筛选混合物方法确定具有抗癌活性化合物的方法是可行的。2、比较两种肺癌细胞与各组混合物作用72h后的平均细胞增殖率,发现增殖率的大小与每组混合物中活性化合物数量有关,含活性化合物较多的处理组中的细胞增殖少,而不含活性化合物的处理组细胞增殖较强。因此,虽然混合后化合物间的相互作用可能对某些混合物的筛选结果造成影响,但是从总体上看,在混合物中活性化合物仍然起到良好的抗癌、抑癌作用。因此,从混合物筛选数据中分析得到活性化合物的设想是可行的。3、大部分化合物混合后对耐药性肺癌细胞系H460/taxR细胞的抑制作用比敏感性肺癌细胞系H460细胞抑制作用强,而单个化合物的筛选结果显示其对H460细胞与H460/taxR细胞的抑制作用基本相同。因此,混合化合物有望作为逆转细胞耐药性的多靶点药物进行研究和开发。4、混合化合物对癌细胞的抑制作用并不仅仅取决于其中对细胞抑制作用最强的单一化合物,还可能取决于每种化合物与其作用靶点的结合能力。5、本实验选取的25、27和48号化合物能够抑制P-糖蛋白的功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1.1 组合化学
• 1.2 高通量药物筛选
• 1.3 系统生物学与多靶点药物
• 1.3.1 系统生物学对药物发现模式与理念革新的影响
• 1.3.2 系统生物学在药物发现中的应用
• 1.4 药物间的相互作用
• 1.5 肿瘤细胞的耐药性及P糖蛋白介导的MDR研究现状
• 1.6 逆转P糖蛋白介导的MDR的研究现状
• 1.6.1 化学药物逆转
• 1.6.2 MDR1反义寡核苷酸逆转
• 1.6.3 核酶逆转
• 1.6.4 逆转P-gp多药耐药性的研究方法
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第二章 化合物混合物的设计与制备
• 2.1 噻唑烷酮化合物库的构成基团
• 2.2 噻唑烷酮化合物库的合成路线
• 2.3 噻唑烷酮类化合物的混合与分组
• 第三章 化合物混合物的体外筛选
• 3.1 主要试剂与材料
• 3.2 主要实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 SRB检测方法
• 3.3.2 肿瘤细胞系对组合化学库的筛选
• 3.3.3 人正常成纤维细胞对组合化学库的筛选
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 肿瘤细胞系的增殖率及活性化合物分析
• 3.4.2 人正常成纤维细胞的增殖率
• 3.5 结论
• 第四章 噻唑烷酮类小分子探针的相互作用研究
• 4.1 试剂与材料
• 4.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 半抑制率的计算
• 4.3.2 数据分析
• 4.4 结果与讨论
• 4.5 结论
• 第五章 化合物抑制P-糖蛋白功能的研究
• 5.1 试剂与材料
• 5.2 实验仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 P-糖蛋白底物和抑制物的药效团模型检验
• 5.3.2 化合物的配制
• 5.3.3 细胞增殖率的影响
• 5.4 结果与讨论
• 5.5 结论
• 附表1
• 附录1
• 附录2
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间公开发表论文情况
• 学位论文评阅及答辩情况表