南极衣藻Chlamydomonas sp. L4胞外冰活性物质研究

论文摘要

冰活性物质（ice-active substances,IASs）与南极冰藻密切相关并显示出冰结合的活性。在经过截留分子量300 kDa的膜透析后仍然保留有很强的冰结合活性。这些大分子物质可以对正在生长的冰晶表面产生蚀刻或其它形状改变,这一点跟鱼抗冻蛋白类似,但是IASs不会明显降低溶液的冰点。除在南极植物和北美洲北部寒冷地区的苔藓中有过发现外,在温带地区植物中没有发现过IASs。尽管IASs的生理功能还不清楚,但它与寒冷环境密切的关系表明它起到一种防冻剂的功能。经检测在实验中所用的5种南极冰藻〔南极衣藻Chlamydomonas sp. L4（南极衣藻L4）、南极绿藻Auricula castrracane B7（南极绿藻B7）,南极硅藻:圆筛藻Coscinodiscus sp.、盒形藻Biddulphia sp.、菱形藻Nitzschia sp.〕中都有IASs的存在,并且活性的大小存在种间差异,其中以南极衣藻L4中IASs的含量最高。IASs是南极冰藻中普遍存在的一种物质,它们在冰藻的低温生存繁殖中起重要作用。目前所报道的IASs都是在极地地区,其他地区还没有报道,说明IASs是一种与寒冷相关的物质。在对冰活性物质的进一步研究中选取IASs产量较高的南极衣藻L4作为实验藻种。南极衣藻L4 IASs的含量受生长温度的影响较大,在低温区间（4～8℃）随着温度的降低IASs的浓度显著升高;生长温度在8～12℃之间浓度变化不大,越是接近冰点,IASs的浓度随温度降低而升高;在温度远高于冰点的时候,IASs浓度与温度变化关系不明显。在生长温度相同的情况下,低温冻融循环的冷激处理会明显提高IASs的浓度。电泳和凝胶过滤的结果都显示南极衣藻L4 IASs是一类分子量呈现一定连续性的物质,染色结果表明IASs是由糖和蛋白组成,还原糖和蛋白含量分别为73.3%和17.8%,高的糖含量保证了IASs的稳定性。IASs分子量一般较大,分子外周包被着多层亲水性的糖链,糖链维持整个分子的稳定性,使它不易被其他分子所分解。南极衣藻L4 IASs有非常好的热稳定性,45℃处理3 h后活性基本不会下降;70℃处理1.5 h之后活性开始降低,3 h后仍有一定活性;在100℃处理0.5 h后仍具有一定抑冰能力,在100℃处理1 h后活性彻底消失。在对结晶速度的影响方面,南极衣藻L4 IASs相比较普通蛋白质（牛血清白蛋白）,可以明显延缓结晶过程。低浓度的IASs（0.1 mg·mL-1）就可以表现出非常强的抑冰活性,并且这一活性强弱随浓度增加的趋势不明显。其抑制冰晶的机理尚不明确,有待进一步的探索。IASs可以保护细胞免受冻融的伤害,为了测试这一推断,以南极衣藻L4和常温卡德藻为材料分别在有和没有IASs存在的情况下经过一个冻融循环,双染色结果显示IASs的存在可以使存活率提高26.2%到28.7%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 南极地区的环境特征
• 1.2 南极冰藻的类群及生态意义
• 1.2.1 南极冰藻的类群
• 1.2.1.1 冰表类群
• 1.2.1.2 冰内类群
• 1.2.1.3 冰底类群
• 1.2.1.4 藻席-丝类群
• 1.2.2 南极冰藻的生态意义
• 1.3 低温对南极冰藻的伤害作用
• 1.3.1 改变生化反应速率
• 1.3.2 改变细胞组成的稳定性
• 1.3.3 冰的直接破坏作用
• 1.4 南极冰藻对低温适应性的机理
• 1.4.1 胞外分泌物的作用
• 1.4.2 藻体中内含物质的变化
• 1.4.3 细胞膜弹性的变化
• 1.4.4 细胞膜成分的改变
• 1.4.5 低温酶类的作用
• 1.5 IASs研究的理论价值和应用前景
• 1.5.1 IASs的特性
• 1.5.2 IASs与抗冻蛋白的区别
• 1.5.3 IASs应用前景
• 1.6 IASs研究动态
• 2 5种南极冰藻胞外冰活性物质的低温诱导及含量的种间差异比较
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验藻种来源
• 2.1.2 仪器与试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 培养条件
• 2.1.5 南极冰藻的复壮、纯化和扩大培养方法
• 2.1.6 南极冰藻冰活性物质的诱导
• 2.1.7 南极冰藻冰活性物质含量的测定
• 2.2 结果与分析
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 3 培养条件对南极衣藻Chlamydomonas sp. L4胞外冰活性物质产量的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 仪器与试剂
• 3.1.3 实验方法
• 3.1.3.1 南极衣藻L4生长曲线和IASs含量变化曲线的测定
• 3.1.3.2 培养温度与冷激对南极衣藻L4 IASs含量的影响
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 南极衣藻L4生长曲线和IASs含量变化曲线
• 3.2.2 培养条件对南极衣藻L4 IASs含量变化的影响
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4 南极衣藻Chlamydomonas sp. L4胞外冰活性物质的分离纯化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验藻种
• 4.1.2 仪器与试剂
• 4.1.3 实验方法
• 4.1.3.1 IASs粗制品的提取
• 4.1.3.2 IASs半纯品的电泳分析
• 4.1.3.3 南极衣藻L4 IASs的凝胶过滤分离
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 南极衣藻L4 IASs粗制品
• 4.2.2 南极衣藻L4 IASs SDS-PAGE电泳结果
• 4.2.3 南极衣藻L4 IASs Sephadex G-200凝胶分离结果
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 5 南极衣藻Chlamydomonas sp. L4胞外冰活性物质的生化组成及稳定性
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验样品
• 5.1.2 仪器与试剂
• 5.1.3 实验方法
• 5.1.3.1 总还原糖的测定
• 5.1.3.2 蛋白含量的测定
• 5.1.3.3 氨基酸组成的测定
• 5.1.3.4 气相色谱法测定单糖组成
• 5.1.3.5 IASs蛋白链的分离
• 5.1.3.6 IASs 稳定性测定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 总还原糖的测定结果
• 5.2.2 蛋白含量的测定结果
• 5.2.3 IASs氨基酸和单糖组成
• 5.2.4 IASs蛋白链的分离结果
• 5.2.5 IASs热稳定性
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 6 南极衣藻Chlamydomonas sp. L4胞外冰活性物质抑制冰晶的活性
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验藻种
• 6.1.2 仪器与试剂
• 6.1.3 实验方法
• 6.1.3.1 IASs对冰晶形态的影响
• 6.1.3.2 IASs对结晶速度的影响
• 6.1.3.3 IASs对南极衣藻和常温卡德藻在冰晶形成时的保护
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 IASs对冰晶形态的影响
• 6.2.2 IASs对结晶速度的影响
• 6.2.3 IASs对南极衣藻L4和常温卡德藻在冰晶形成时的保护
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 7 结语
• 7.1 几种冰藻IASs的诱导，含量及活性的比较
• 7.2 培养温度对南极衣藻 L4 IASs 产量的影响
• 7.3 南极衣藻L4 IASs的分子特性
• 7.4 南极衣藻L4 IASs的生化组成及稳定性
• 7.5 南极衣藻L4 IASs抑制冰晶的活性测定
• 参考文献
• 致谢
• 发表文章