短小芽孢杆菌胞内NADPH 的再生及羟基脂肪酸发酵优化的研究

论文摘要

C18长碳链羟基脂肪酸中的ω-1、ω-2、ω-3-羟基脂肪酸（ω-1、ω-2、ω-3-HFA）可应用于机械、化工、食品等工业,是当今绿色聚合物材料研究开发中最理想的单体成分之一。本文以一株经过诱变后获得的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）突变菌株M-F641作为出发菌株,为了能够进一步提高油酸转化率和羟基脂肪酸得率,对其生长和代谢规律进行了研究,并在单因素（培养温度、初始pH和装液量）实验的基础上采用响应面分析法,以油酸转化率作为指标,优化了发酵工艺条件,并对优化后的发酵条件进行了验证。在对碳源代谢研究的基础上,确定了最佳碳源为葡萄糖,并结合胞内微生物糖发酵代谢途径的分析,建立了一种以木糖为辅助底物实现辅酶NADPH再生的新方法。本文主要研究结果如下:（1）通过对碱法和酸法两种不同的甲酯化方法进行比较,得出以酸法进行甲酯化,并通过正交实验（酯化时间、温度、硫酸-甲醇体积比）,确定了以硫酸-甲醇法对脂肪酸进行甲酯化的最佳条件为2%硫酸-甲醇,70℃水浴1h。（2）通过对短小芽孢杆菌突变株M-F641生长和代谢规律的研究,得出其生长所需的最适碳源为葡萄糖,最适葡萄糖浓度为20g/L,并结合胞内葡萄糖代谢规律的分析,以木糖（木糖添加量10g/L）为辅助底物进行辅酶NADPH的再生。与不添加木糖（0g/L）的对照组相比,NADPH的含量增加了0.0345mmol/L,增加率为40.68%;并且与对照组（油酸转化率70.04%,ω-羟基脂肪酸得率18.90%）相比,油酸转化率（75.31%）和ω-羟基脂肪酸得率（22.61%）也都有了较大的提高,有效地实现了辅酶NADPH的再生。（3）短小芽孢杆菌突变株M-F641最佳发酵工艺条件的确定。在单因素（培养温度、初始pH和装液量）实验的基础上,通过响应面优化法,确定了BP M-F641最佳发酵工艺条件:装液量为60mL/250mL,温度30℃,pH值7.4,在此条件下,NADPH含量最大值为0.0268mmol/L,测得油酸转化率为74.58%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 绪论
• 1.1 羟基脂肪酸概述
• 1.2 羟基脂肪酸的主要来源
• 1.2.1 化学合成途径
• 1.2.2 生物合成途径
• 1.3 合成羟基脂肪酸的微生物
• 1.4 脂肪酸羟基化反应的作用机制
• 1.4.1 微生物中羟化酶的分类及其特点
• 1.4.2 微生物中羟化酶的作用机制
• 1.4.3 P450 单加氧酶系在微生物细胞中的分布
• 1.5 辅酶NADPH 的性质
• 1.6 辅酶NADPH 在体内的代谢产生途径
• 1.6.1 HMP 途径（单磷酸己糖途径）
• 1.6.2 ED 途径（2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸裂解途径）
• 1.7 辅酶NADPH 的再生方法
• 1.7.1 辅酶的酶反应再生
• 1.7.2 辅酶的化学法再生
• 1.7.3 辅酶的电化学法再生
• 1.7.4 辅酶的光化学法再生
• 1.7.5 辅酶的微生物法再生
• 1.8 研究依据、目的和内容
• 2 脂肪酸甲酯化条件的确立和发酵产物的鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 硫酸-甲醇溶液的制备
• 2.1.4 气相色谱条件
• 2.1.5 油酸及其衍生物含量测定
• 2.1.6 样品油酸的衍生化方法
• 2.1.7 发酵液中油酸衍生物（ω-羟基脂肪酸）的提取和甲酯化
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 油酸和棕榈酸标准品气相色谱图
• 2.2.2 硫酸-甲醇浓度（V/V）对油酸甲酯化的影响
• 2.2.3 温度对油酸甲酯化的影响
• 2.2.4 反应时间对油酸甲酯化的影响
• 2.2.5 硫酸-甲醇法用于油酸甲酯化的正交优化实验
• 2.2.7 GC-MS 测定发酵产物
• 2.3 本章小结
• 3 Bacillus pumilus 胞内辅酶 NADPH 再生构建与机理分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要仪器设备
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 菌株和培养基
• 3.1.4 菌种培养及发酵方法
• 3.1.4.1 菌种活化及种子制备
• 3.1.5 分析方法
• 3.1.5.1 葡萄糖浓度标准曲线的制定及发酵液中葡萄糖含量的测定
• 3.1.5.2 NADPH 标准曲线的制定及胞内NADPH 含量测定
• 3.1.5.3 发酵液中羟基脂肪酸分析及含量测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 短小芽孢杆菌胞内葡萄糖代谢及脂肪酸转化途径分析
• 3.2.2 不同装液量下葡萄糖代谢与短小芽孢杆菌胞内NADPH 含量
• 3.2.3 木糖添加量对NADPH 含量及ω-羟基脂肪酸产量的影响
• 3.3 本章小结
• 4 Bacillus pumilus M-F641 最佳发酵工艺的研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 主要仪器设备
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 菌种
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 硫酸甲醇溶液的配置
• 4.1.6 菌种活化及种子制备
• 4.1.7 细胞生物量测定
• 4.1.8 发酵液中羟基脂肪酸分析及含量测定
• 4.1.9 单因素实验
• 4.1.10 响应面实验分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 摇瓶培养条件下细胞生长曲线的测定
• 4.2.2 碳源种类对菌体生长及油酸转化率的影响
• 4.2.3 初始葡萄糖浓度对菌体生长及油酸转化率的影响
• 4.2.4 培养温度对菌体生长及油酸转化率的影响
• 4.2.5 培养基初始pH 值对菌体生长及油酸转化率的影响
• 4.2.6 装液量对菌种转化油酸生成ω-羟基脂肪酸得率的影响
• 4.2.7 响应面分析实验结果
• 4.2.7.1 回归方程的建立与分析
• 4.2.7.2 培养因素间交互作用分析与发酵条件的优化
• 4.2.7.3 验证实验
• 4.3 本章小结
• 5 结论和进一步研究设想
• 5.1 实验结论
• 5.2 进一步研究设想
• 参考文献
• 在学研究成果
• 致谢