Toll样受体和趋化因子受体在原发性胆汁性肝硬化中致病机制的研究

论文摘要

原发性胆汁性肝硬化是一种由于免疫系统对自身肝脏进行攻击而引起的慢性胆汁淤积性肝脏自身免疫性疾病,高发于中年女性。患者发病后会导致胆管阻塞和胆汁淤积,造成特异性的胆管上皮细胞损伤,从而引发肝脏的纤维化,最后演变为肝硬化和肝功能衰竭,严重威胁患者的生命。由于获取早期发病的临床肝脏样本十分困难,因此对原发性胆汁性肝硬化发病机制的探索及治疗靶点的开发均主要以该疾病的动物模型-dnTGF-β RⅡ小鼠作为研究工具。该模型很好地模拟了人类原发性胆汁性肝硬化的主要表型特征：自发产生抗线粒体的自身抗体；血清中炎性细胞因子水平升高；病理组织学检查可发现伴随肝内胆管的破坏,肝脏汇管区有大量的CD4T细胞、CD8T细胞等淋巴细胞的浸润；此外dnTGF-β小鼠还有自发的结肠炎,也可以作为研究肝脏炎症和肠道微环境相互作用的模型。虽然以往的工作利用dnTGF-β RⅡ小鼠这一疾病模型对于该自身免疫性肝病发病早期的一些免疫学致病机制进行了初步探究,包括CD8T细胞的致病性,细胞因子和调节性B细胞对疾病进程的影响等；但是对该疾病的致病机制仍未有全面的了解,还有很多未知的领域,包括天然免疫在该疾病中所发挥的作用以及趋化因子及其配体在介导该疾病炎性浸润中的机制等均未有明确的报道。因此,本研究以dnTGF-β RⅡ小鼠以及Toll样受体缺失或者趋化因子受体缺失的dnTGF-β RⅡ小鼠为研究原发性胆汁性肝硬化的动物模型,利用细胞免疫学、分子生物学以及医学病理学的实验方法方法对该疾病致病过程中天然免疫受体Toll样受体以及趋化因子受体CXCR3发挥作用的机制进行深入探讨,为阐明原发性胆汁性肝硬化的致病机制以及开发该疾病有效的治疗靶点提供证据支持。本研究得到的实验结果如下：1.环境因素的改变（肠道菌群清除）影响了原发性胆汁性肝硬化小鼠模型的发病程度我们用含有甲硝锉,氨苄青霉素,新霉素以及万古霉素这四种抗生素的水从4周龄起饲养SPF级的dnTGF-β RⅡ （TG）小鼠以清除肠道中绝大多数的共生菌。在抗生素喂养12周,即小鼠15周龄时杀鼠,对其肝脏的病理学分析发现与非抗生素水喂养的对照组相比,抗生素喂养加重了TG小鼠的胆管炎,表现为肝脏炎性浸润的增多以及胆管破坏的加重。2. Toll样受体2缺失加重了dnTGF-β RⅡ小鼠自发的胆管炎及结肠炎与野生型（WT）小鼠相比,tlr2在dnTGF-β RⅡ （TG）小鼠中有较高的表达,因此我们将TG小鼠与Toll样受体2（TLR2）敲除小鼠进行杂交,得到TLR2-/-dnTGF-β RⅡ （TGT2）小鼠。首先,对其肝脏的病理学分析发现,与TG小鼠相比,TGT2小鼠肝脏汇管区的炎性浸润及肝内胆管的破坏有明显的加重。细胞学分析的结果显示与TG小鼠相比,TGT2小鼠肝脏中T细胞尤其是CD4T细胞的浸润增加了,并且这些浸润的CD4T和CD8T中呈现效应性记忆性表型（CD44highCD62Llow）的细胞明显增多。其次,肠道病理学的分析发现TLR2敲除加重了TG小鼠的自发结肠炎。与TG小鼠相比TGT2小鼠不仅体重明显下降,结肠重量显著上升,而且结肠中的炎性浸润已经扩展到整个粘膜的厚度,腺体和杯状细胞受到严重破坏,并伴随有隐窝囊肿的存在。再次,对细胞因子的检测结果表明,与TG小鼠相比,TGT2小鼠血清中TNF-α和IFN-γ的浓度明显升高,并且在TGT2小鼠的肝脏中il6的基因表达显著增加。对于肝脏中IL-6相关的信号通路的检测发现与TG小鼠相比,TGT2小鼠肝脏中STAT3磷酸化的水平明显升高。最后,为了从相反的方向证明TLR2在TG小鼠发病过程中的作用,我们计划用TLR2的特异性配体Pam3CSK4来对TG小鼠进行高剂量单次注射和低剂量连续注射的处理,从而更加全面地阐明TLR2在TG小鼠发病中的作用机制。3. Toll样受体4缺失有加重dnTGF-β RⅡ小鼠肝脏炎症及肠道炎症的趋势与WT小鼠相比,tlr4在TG小鼠中的表达升高,因此我们对杂交所得到的TLR4-/-dnTGF-β RⅡ （TGT4）小鼠进行了一系列的细胞免疫学和医学病理学的分析。结果发现：与TG小鼠相比TGT4小鼠肝脏中浸润的T淋巴细胞的比例有所增加；并且CD8T细胞在总的T细胞中所占的比例有明显的上升；其肝脏中浸润的效应性记忆CD8T细胞（CD8Tem）无论在CD8T细胞中所占的比例还是其绝对数都有明显的增加。虽然TLR4敲除对于dnTGF-β RⅡ小鼠结肠炎症的影响没有统计学上的显著性差异,但是无论是通过病理切片的观察还是统计数据的分析,我们都可以发现TGT4小鼠与TG小鼠相比结肠炎有加重的趋势。4. CXCR3在dnTGF-β RⅡ小鼠致病过程中作用的初步探讨首先,我们发现与WT小鼠相比TG小鼠肝脏中趋化因子CXCL9和CXCL10的浓度有明显上升。然后,流式分析的结果显示在TG小鼠肝脏中表达这两种趋化因子的受体CXCR3的T细胞比WT明显增多。接下来,来自TG小鼠或者敲除了CXCR3的TG小鼠中的T细胞的过继转输实验将为证明CXCR3介导T细胞向TG小鼠肝脏迁移提供更加有力的证据。综上所述,本研究证明了TLR2缺失可以加重原发性胆汁性肝硬化小鼠模型中的胆管炎以及自发性结肠炎。并且发现CXCR3可能介导了该小鼠模型中T细胞向肝脏炎性部位的迁移。我们的研究首次证明了在该疾病模型中天然免疫受体TLR2的敲除促进了肝脏和肠道的炎症。并且首次在该疾病模型中探讨肠道微环境与肝脏炎症之间的关系,这为阐明原发性胆汁性肝硬化的致病机制以及寻找该疾病有效的治疗靶点提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论（自身免疫性肝脏疾病的研究进展）
• 1.1 前言
• 1.2 自身免疫性肝脏疾病
• 1.2.1 自身免疫性疾病的概况
• 1.2.2 自身免疫性肝脏疾病的研究进展
• 1.2.3 自身免疫性肝脏疾病与肠道微环境的关系
• 1.2.4 天然免疫模式识别受体在自身免疫性肝病过程中的机制研究
• 1.3 原发性胆汁性肝硬化
• 1.3.1 原发性胆汁性肝硬化的研究意义
• 1.3.2 原发性胆汁性肝硬化致病机制的研究进展
• 1.3.2.1 dnTGF-βRⅡ转基因鼠作为PBC免疫病理研究模型及CD8+T细胞的致病作用
• 1.3.2.2 调节性B细胞在PBC样肝脏损伤过程中的作用
• 1.3.2.3 调节性T细胞在PBC中的作用
• 1.4 天然免疫及Toll样受体在PBC发病过程中的作用研究
• 1.4.1 Toll样受体及肝脏微环境
• 1.4.2 TLRs与PBC
• 1.5 趋化因子及其受体
• 1.5.1 趋化因子及其受体的分类与功能概述
• 1.5.2 趋化因子及其受体在自身免疫性疾病中的研究进展
• 1.5.3 趋化因子受体CXCR3在自身免疫性疾病以及肝脏特异性疾病中的研究现状
• 1.6 特色与创新之处
• 1.6.1 TLRs在PBC致病中作用机制研究的特色与创新性
• 1.6.2 趋化因子受体CXCR3及其配体在PBC致病中作用机制研究的特色与创新性
• 1.7 结语
• 第二章 实验材料及方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 小鼠信息
• 2.1.2 实验试剂
• 2.2 实验仪器
• 2.3 实验步骤
• 2.3.1 病理制片及H&E染色
• 2.3.2 肝脏和肠道组织RNA提取、逆转录及Real-time PCR
• 2.3.3 小鼠肝脏及脾脏单个核细胞分离
• 2.3.4 流式检测细胞表面分子及细胞因子分泌能力
• 2.3.5 CBA（详见BD Cytometric Bead Array Mouse Th1/Th12/Th17 Cytokine Kit说明书）
• 2.3.6 肝脏组织蛋白提取,BCA定量及Western Blot检测
• 2.3.7 小鼠表型鉴定
• 2.3.8 ELISA
• 2.3.9 统计学分析方法
• 第三章 实验结果（第一部分）Toll样受体在原发性胆汁性肝硬化发病中的作用机制研究
• 3.1 引言
• 3.2 环境因素的改变（肠道菌群缺失）影响了原发性胆汁性肝硬化小鼠模型的发病程度
• 3.2.1 抗生素喂养不能减轻dnTGF-βRⅡ小鼠中的结肠炎
• 3.2.2 抗生素喂养加重了血TGF-βRⅡ小鼠肝脏的炎性浸润和胆管破坏
• 3.2.3 小结与讨论
• 3.3 TLR2敲除加重了原发性胆汁性肝硬化小鼠模型中的胆管炎和肠炎
• 3.3.1 TLR2在dnTGF-βRⅡ小鼠的肝脏中高表达
• 3.3.2 TLR2敲除促进了dnTGF-βRⅡ小鼠肝脏中的炎症
• 3.3.2.1 TLR2敲除加重了dnTGF-βRⅡ小鼠肝脏的汇管区炎症和胆管破坏
• 3.3.2.2 TLR2敲除增加了dnTGF-βRⅡ小鼠肝脏中T淋巴细胞的浸润
• 3.3.2.3 TLR2敲除提高了dnTGF-βRⅡ小鼠肝脏中CD4T/CD8T的比率
• 3.3.2.4 TLR2敲除促进了dnTGF-βRⅡ小鼠肝脏中效应性记忆T细胞（Tem）的增多
• 3.3.2.5 TLR2敲除降低了dnTGF-βRⅡ小鼠肝脏中CD8T和NK细胞分泌IFN-γ的能力
• 3.3.3 TLR2敲除对于dnTGF-βRⅡ小鼠脾脏中单个核细胞亚群的影响
• 3.3.3.1 TLR2敲除减少了dnTGF-βRⅡ小鼠脾脏中单个核细胞的数量
• 3.3.3.2 TLR2敲除降低了dnTGF-βRⅡ小鼠脾脏中单个核细胞各亚群分泌IFN-γ的能力
• 3.3.4 TLR2敲除加重了dnTGF-βRⅡ小鼠的自发肠炎
• 3.3.5 TLR2敲除提高了dnTGF-βRⅡ小鼠血清和肝脏中细胞因子的水平
• 3.3.6 TLR2敲除改变了dnTGF-βRⅡ小鼠肝脏中炎症相关信号通路的活化
• 3.3.7 TLR2的刺激剂（Pam3CSK4）治疗dnTGF-βR Ⅱ小鼠发病的尝试
• 3.3.8 小结与讨论
• 3.4 TLR4在原发性胆汁性肝硬化发病中作用的探索
• 3.4.1 TLR4在dnTGF-βRⅡ小鼠的肝脏中高表达
• 3.4.2 TLR4敲除对于dnTGF-βRⅡ小鼠肝脏炎症的影响
• 3.4.2.1 TLR4敲除增加了dnTGF-βRⅡ小鼠肝脏中浸润的T细胞的比例
• 3.4.2.2 TLR4敲除降低了dnTGF-βRⅡ小鼠肝脏中CD4T/CD8T的比率
• 3.4.2.3 TLR4敲除增加了dnTGF-βRⅡ小鼠肝脏中浸润的效应性记忆CD8T细胞（CD8Tem）的比例及数量
• 3.4.3 TLR4敲除对dnTGF-βRⅡ小鼠脾脏中单个核细胞各亚群的影响
• 3.4.4 TLR4敲除有加重dnTGF-βRⅡ小鼠自发肠炎的趋势
• 3.4.5 TLR4敲除对于dnTGF-βRⅡ小鼠血清中细胞因子水平的影响
• 3.4.6 小结
• 第四章 实验结果（第二部分）趋化因子受体CXCR3在原发性胆汁性肝硬化中致病机制的初步探究
• 4.1 引言
• 4.2 dnTGF-βRⅡ小鼠肝脏中存在高浓度的CXCL9和CXCL10
• 4.3 dnTGF-βRⅡ小鼠肝脏中存在大量的CD4T和CD8T细胞浸润
• 4.4 dnTGF-βRⅡ小鼠肝脏中表达CXCR3的CD4T和CD8T细胞增多
• 4.5 进一步的研究计划（转输实验探索CXCR3在dnTGF-βRⅡ小鼠来源的T细胞向肝脏迁移过程中所发挥的作用）
• 第五章 实验结果（第三部分）Sorafenib通过促进Kuffer细胞分泌IL-6活化肝脏中STAT3以减轻肝脏损伤及纤维化
• 5.1 引言
• 4诱导的已经建立的肝脏损伤和肝脏纤维化'>5.2 Sorafenib通过上调肝脏中STAT3的磷酸化减轻CCl₄诱导的已经建立的肝脏损伤和肝脏纤维化
• 4诱导的小鼠肝脏中STAT3磷酸化的水平及IL-6的基因表达'>5.3 Sorafenib处理同时提高了CCl₄诱导的小鼠肝脏中STAT3磷酸化的水平及IL-6的基因表达
• 5.4 IL-6敲除消除了Sorafenib对于用药组小鼠肝脏中STAT3磷酸化的促进作用
• 5.5 Kuffer细胞清除消除了Sorafenib对于用药组小鼠肝脏中STAT3磷酸化及IL-6基因表达的促进作用
• 5.6 小结与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果
• 附录