论文摘要
目的1.研究雷公藤内酯醇（TL）对人纤维肉瘤HT-1080细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的影响;2.研究TL调控MMP-9表达的意义;3.探讨TL调控MMP-9表达的机制。方法1.选择人纤维肉瘤细胞系HT-1080为研究对象,常规培养、传代,药物的3个工作浓度分别为6nM、12nM和18nM,处理时间均为72小时;2.采用MMT法检测TL对HT-1080细胞增殖能力的影响;3.用流式细胞仪检测TL致HT-1080细胞凋亡情况;4.运用RT-PCR检测TL对9个基因mRNA表达的影响,这些基因是:MMP-9和-2,基质金属蛋白酶组织抑制物（TIMP）-1、-2、-3和-4,DNA甲基转移酶（DNMT）-1、-3A和-3B;5.用明胶酶谱实验检测TL对HT-1080细胞MMP-9和-2活性的影响;6.用Transwell侵袭实验检测TL对HT-1080细胞体外侵袭能力的影响;7.用甲基化特异性PCR（MSP）检测TL对MMP-9基因甲基化水平的影响;8.用Western blotting检测TL对DNMT-1、-3A和-3B蛋白表达的影响。结果1.TL作用72小时,随药物浓度的增加,HT-1080细胞的增殖逐渐受到抑制;其中,半数抑制浓度约为25nM;2.浓度分别为6 nM、12 nM和18 nM的TL处理72小时后,HT-1080细胞的凋亡率分别为16.0%、17.3%和18.8%,对照组凋亡率为17.7%;3.18 nM TL处理HT-1080细胞72小时后,MMP-9 mRNA的表达明显下调（P＜0.05）,但MMP-2、TIMP-1/-2/-3/-4 mRNA的表达无明显变化（P均＞0.05）;6 nM和12 nM TL处理组上述基因的mRNA表达均无明显变化（P均＞0.05）;4.12 nM TL处理HT-1080细胞72小时后,在细胞无血清培养基上清中检测到的MMP-9的活性明显下调（P＜0.05）,18 nM TL处理组无血清培养基上清中则基本检测不到MMP-9（P＜0.01）;3个药物处理组MMP-2的活性均无明显变化（P均＞0.05）;5.Transwell侵袭实验发现,18nM TL处理72小时后,穿过人工基底膜的细胞数明显减少,约相当于对照组的65%（P＜0.05）;抗MMP-9单克隆抗体处理组穿过人工基底膜的细胞数亦明显减少,约相当于对照组的50%（P＜0.05）;6nM和12nM TL处理组穿过人工基底膜的细胞数均无明显变化（P均＞0.05）;6.18 nM TL处理HT-1080细胞72小时后,MMP-9基因甲基化水平明显上调（P＜0.05）;6nM和12 nM TL处理组MMP-9基因甲基化水平均无明显变化（P均＞0.05）;7.18 nM TL处理HT-1080细胞72小时后,DNMT-1和-3A mRNA及蛋白表达明显上调（P均＜0.05）,DNMT-3B mRNA及蛋白表达无明显变化（P＞0.05）;6nM和12nM TL处理组DNMT-1、-3A和-3BmRNA及蛋白表达均无明显变化（P均＞0.05）。结论1.TL抑制HT-1080细胞的增殖;2.TL可能通过抑制MMP-9的表达及活性而抑制肿瘤细胞体外侵袭能力;3.首次证实TL上调MMP-9基因甲基化水平;4.首次证实TL上调DNMT-1和-3A的表达。