包菜立枯丝核菌球腐病的病原学研究

论文摘要

球腐病是在包菜上发生的一种重要病害,能引起整个包菜叶球的腐烂,严重影响包菜的产量与品质。该病多年来由于流行范围不广,造成的经济损失不大,一直未引起研究者对此病的关注,国内外也仅有关于此病的病原初报。近年来在湖北长阳高山蔬菜生产基地频繁发生该病,并造成了严重的经济损失。本研究旨在确定引起包菜球腐病的病原,了解病菌的寄主范围、生物学特性以及进行杀菌剂的初步筛选和测定部分栽培品种的抗性,并观察了病菌对包菜叶片的侵入过程及在此过程中包菜叶片内胞壁降解酶活性的变化。研究结果如下:从包菜病株上分离得到的菌株在PDA平板上培养3天后菌落直径为9cm左右。菌丝初为无色,成熟后逐渐变为褐色。菌丝直径4.90-7.98μm,直角或锐角分枝,分枝处明显缢缩,距分枝不远处有一隔膜,菌丝细胞多核。菌核颗粒状、褐色,内外颜色一致。用分离菌株接种离体包菜叶片后叶片上出现黑褐色圆形至不规则形病斑,与田间发病症状相同,从接种发病的叶片上分离到的菌株与接种所用菌株的培养性状和形态特征相同,证实该菌株为致病菌。rDNA-ITS测序结果与GeneBank中的序列进行同源性比较发现菌株与Thanatephorus cucumeris和Rhizoctonia solani序列的同源性高达99%,且融合群为AG 2-1。根据形态学特征和分子鉴定结果,确认该病原菌为Rhizoctonia solani AG 2-1。病原菌生物学特性研究结果表明,病菌在有无光照的条件下均可生长和形成菌核,光照和光暗交替最有利于菌丝的生长,黑暗条件下有利于菌核形成。该菌株在5-30℃的范围内均能生长和产孢,25℃为菌丝生长最适温度。病菌在pH值为4-10的PDA培养基上菌丝均能正常生长,其中以pH6-7生长最快。病菌能够有效利用多种碳源和氮源,分别以淀粉为碳源以及以酵母膏为氮源时生长最好。试验证明45℃的温水处理10min可杀死菌丝体、50℃的温水处理10min可抑制菌核萌发。PDA平板抑菌实验结果表明,供试六种药剂在设置的不同浓度下对病原菌的生长都有一定的抑制作用,其中10%爱苗乳油和50%多菌灵可湿性粉剂对菌丝生长有很好的抑制效果,10%世高可分散粒剂抑制效果最差。寄主范围测定结果表明,病菌能侵染5种十字花科植物,包括包菜、大白菜、小白菜、萝卜、油菜,还能侵染豌豆、蚕豆、番茄、棉花、黄瓜和玉米。对14种栽培品种的抗性测试结果表明,两关、永明、冠军较为抗病,12089和7001较为感病。用菌丝块接种离体包菜叶片,接种后不同时间点取样,对样品进行组织脱色、染色,观察病原菌对寄主植物的侵染过程。结果表明,接种9h后病原菌开始侵入寄主,病菌能通过表皮和气孔两种方式侵染叶片,后期气孔侵入的比率逐渐增加。侵染过程中病原菌可产生侵染菌丝直接侵入,也可形成球形附着胞、分枝状附着胞和侵染垫后再侵入。接种24h后寄主的叶肉细胞被大量降解。测定各接种时间点包菜叶片内病原菌产生的胞壁降解酶活性,结果表明,接种后叶片内4种胞壁降解酶（纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酯酶）的活性较接种前显著增强。接种12h后4种酶的酶活均呈现出加速上升的趋势,纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶在24h时酶活均为对照叶片的2倍多。各酶均在36h到48h达到酶活的高峰,随后酶活逐渐下降。其中48h时纤维素酶的活性是对照叶片的2.64倍,36h时多聚半乳糖醛酸酶的活性是对照叶片的2.62倍,48h时果胶酯酶和果胶裂解酶的酶活为对照叶片的1.65和1.59倍。叶片接种96h后,测定病斑周围黄褐色区域和中间黑色区域的胞壁降解酶活性,分析结果显示,在两个区域中纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶的酶活都显著高于果胶酯酶和果胶裂解酶。病斑的黄褐色部位酶活最高,纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶的活性分别是对照叶片的3.18倍和3.39倍,是黑色部位酶活的2.12被和2.28倍。因此纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶在R.solani AG 2-1成功侵染包菜叶片、破坏寄主细胞的过程中起着重要的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 包菜与包菜病害
• 1.1 包菜的栽培历史
• 1.2 立枯丝核菌引起的包菜病害
• 1.3 包菜上的其他病害
• 2 立枯丝核菌的研究现状
• 2.1 立枯丝核菌的融合群
• 2.2 枯丝核菌的分类方法
• 3 植物病原菌产生的胞壁降解酶及其在致病过程中的作用
• 3.1 胞壁降解酶的种类及特性
• 3.2 植物病原菌的胞壁降解酶在致病过程中的作用
• 4 研究目的与意义
• 第二章 包菜立枯丝核菌球腐病的病原鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 包菜茎腐病病株的采集、菌株的分离培养与纯化
• 1.1.1 包菜茎腐病病株的采集
• 1.1.2 病原菌的分离培养与纯化
• 1.2 病原菌致病性测定
• 1.2.1 菌丝块接种
• 1.2.2 病原菌的再分离
• 1.3 病原菌的形态学鉴定
• 1.3.1 菌落形态、菌丝形态的观察
• 1.3.2 多核现象的观察
• 1.3.3 菌核的观察
• 1.3.4 形态学鉴定依据
• 1.4 rDNA-ITS鉴定
• 1.4.1 菌丝体的培养、收集
• 1.4.2 DNA提取
• 1.4.3 扩增引物
• 1.4.4 PCR反应体系与反应条件
• 1.4.5 序列测定与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 致病性测定
• 2.2 菌株的形态学鉴定
• 2.2.1 菌落形态、菌丝形态的观察
• 2.2.2 多核现象的观察
• 2.2.3 菌核的观察
• 2.2.4 形态学鉴定
• 2.3 rDNA-ITS序列分析
• 3 结论与讨论
• 第三章 包菜球腐病菌生物学特性的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 光照对病原菌菌丝体生长及菌核形成的影响
• 1.2 不同温度对病原菌菌丝体生长的影响
• 1.3 不同pH值对病原菌菌丝体生长的影响
• 1.4 不同碳源对病原菌菌丝体生长的影响
• 1.5 不同氮源对病原菌菌丝体生长的影响
• 1.6 病原菌菌丝体与菌核致死温度的测定
• 1.7 杀菌剂对病原菌菌丝体生长的抑制作用
• 1.8 病原菌寄主范围的测定
• 1.9 不同包菜品种对茎腐病菌的抗性测定
• 1.10 数据统计与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 光照对病原菌菌丝体生长及菌核形成的影响
• 2.2 不同温度对病原菌菌丝体生长的影响
• 2.3 不同pH值对病原菌菌丝体生长的影响
• 2.4 不同碳源对病原菌菌丝体生长的影响
• 2.5 不同氮源对病原菌菌丝体生长的影响
• 2.6 病原菌菌丝体与菌核致死温度的测定
• 2.7 不同药剂对病原菌的毒力测定
• 2.8 病原菌寄主范围的测定
• 2.9 不同包菜品种对球腐病菌的抗性测定
• 3 结论与讨论
• 第四章 包菜球腐病菌对包菜叶片侵染过程的观察
• 1 材料与方法
• 1.1 供试植物
• 1.2 菌丝块接种
• 1.3 接种组织的染色与保存
• 1.4 病原菌侵染过程的观察
• 1.4.1 取样镜检、拍照
• 1.4.2 侵染结构、侵染方式的观察
• 2 结果与分析
• 2.1 病菌的侵染方式
• 2.2 病菌形成的侵染结构
• 2.3 病菌的侵染过程
• 3 结论与讨论
• 第五章 包菜立枯丝核菌的胞壁降解酶及其在致病过程中的作用
• 1 材料与方法
• 1.1 供试植物
• 1.2 不同接种时期胞壁降解酶活性的测定
• 1.2.1 菌丝块接种
• 1.2.2 包菜病组织内胞壁降解酶粗酶液的提取及纯化
• 1.2.3 包菜立枯丝核菌胞壁降解的测定
• 1.3 病斑不同部位胞壁降解酶活性的测定
• 1.4 数据统计与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 不同接种时期胞壁降解酶的活性
• 2.2 病斑不同部位胞壁降解酶的活性
• 3 结论与讨论
• 参考文献
• 附录 缩写词
• 致谢