论文摘要
本研究采用胶体金免疫层析技术（GICA）研制一滴血一次实验检测两种疾病,制备艾滋病毒（HIV）抗体和梅毒（TP）抗体一步双联免疫胶体金快速诊断试剂盒,经过实验条件优选,使此检测方法灵敏、精准、特异,操作简便、快速,提高技术含量,降低检测成本,便于流动监测,使其适用于现场实地监测,达到及时准确地对HIV和TP进行筛查、监测的目的。本研究对HIV和TP的抗原片断进行了优化选择,通过计算机分析同源序列确定了新的抗原位点。成功构建了由HIV-1/2和TP外膜蛋白多个抗原位点串联基因片段的表达载体pRSETB-env和pRSETB-tp,在原核表达载体系统中对HIV-1gp41/gp120、HIV-2gp125/gp36及TpN15、TpN17、TpN44.5、TpN47多个抗原位点同源序列合成基因进行表达、纯化并鉴定其活性,采用胶体金免疫层析技术（GICA）双联HIV和TP抗原,一步同时检测HIV和TP抗体。结果显示目的基因在BL21中有较高表达率,纯化后表达蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可见与设计相对分子质量相符的蛋白带。免疫印迹、ELISA试验显示pRSETB-env质粒的HIV-1/2表达蛋白与HIV-1及HIV-2患者血清都能较好的结合,与其他患者血清无交叉反应;pRSETB-tp质粒的TP表达蛋白与TP患者血清都能较好的结合,与其他患者血清无交叉反应。成功构建了一步法检测HIV和TP的胶体金诊断试剂,胶体金试纸能高效的检测HIV和TP患者血清,具有较高的特异性和敏感性。为一步、同时、快速检测HIV和TP抗体试剂盒的研制和开发提供了重要的研究成果,具有广阔的应用前景。
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提要缩略词索引表1. 论文中用到的特殊标称2. 常用英文缩写及其对应的中英文全称前言第一章 文献综述1 HIV 实验室检测技术进展1.1 免疫学方法1.2 核酸检测方法1.3 基因芯片技术的应用1.4 胶体金免疫渗滤法快速检测HIV-1/2 抗体1.5 展望2. 梅毒螺旋体实验室检测技术研究进展2.1 病原体的检测2.2 梅毒血清学试验2.3 基因诊断技术—聚合酶链反应（PCR）2.4 展望3 GICA 检测技术研究进展3.1 胶体金免疫结合试验的检测原理3.2 GICA 试剂的制作3.3 胶体金免疫结合试验的应用3.4 胶体金免疫结合试验的应用展望第二章 材料和方法1 材料1.1 菌株和质粒1.2 主要试剂1.3 主要仪器1.4 主要的试剂盒、抗体及限制性内切酶1.5 试剂的配制2 实验方法2.1 HIV-1/2 和TP 主要优势抗原原核表达载体的构建2.2 HIV-1/2 和TP 主要优势抗原的小量表达2.3 HIV-1/2 和TP 主要优势抗原的大量表达及纯化2.4 ELISA 法检测各纯化目的蛋白的生物学活性2.5 A1 包涵体蛋白的复性2.6 重组蛋白 A1 和 B1 胶体金联合检测试纸的制备2.7 TP/HIV 联合检测试纸条的抗体检测第三章 结果1 重组HIV-1/2 和TP 主要优势抗原原核表达载体的鉴定1.1 重组pA1 原核表达载体的鉴定1.2 重组pA2～pA7 原核表达载体的鉴定1.3 重组TP 主要优势抗原原核表达载体的鉴定2 重组HIV-1/2 和TP 主要优势抗原的小量表达2.1 重组HIV-1/2 型主要优势抗原的小量表达鉴定2.2 重组Tp 主要优势抗原的小量表达鉴定2.3 主要优势抗原在宿主菌中表达形式的鉴定3 重组HIV-1/2 和TP 主要优势抗原的大量表达及纯化3.1 重组A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7 蛋白的纯化3.2 重组 B1、B2、B3 蛋白的纯化4 ELISA 法检测各纯化目的蛋白的生物学活性4.1 ELISA 法检测A1～A7 纯化目的蛋白的生物学活性4.2 ELISA 法检测 B1、B2、B3 纯化目的蛋白的生物学活性5 A1 包涵体蛋白的复性6 重组蛋白A1和B1胶体金联合检测试纸的制备6.1 重组 A1 和 B1 蛋白和胶体金结合最佳 pH 值的测定6.2 重组 A1 和 B1 蛋白和胶体金结合最小浓度的测定6.3 重组蛋白 A1 和 B1 标记胶体金溶液的大量制备6.4 重组蛋白 A1 和 B1 胶体金联合检测试纸的制备7 TP/HIV 联合检测试纸条的抗体检测第四章 讨论结论参考文献攻读博士学位期间已发表的论文中文摘要ABSTRACT致谢
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