绵羊体细胞克隆及早期克隆胚碎裂机制研究

论文摘要

本文以体外成熟不同时间卵母细胞为胞质受体,以第4-10代成体雄性绵羊成纤维细胞为核供体,对去核、融合、不同激活方法、卵裂率、桑/囊胚率、囊胚率及克隆胚体内发育等作了较系统地研究。并对影响克隆胚发育的早期胚胎的碎裂现象及其可能机制作了初步探讨。主要结果与结论如下:一、克隆胚胎的体外与体内发育1.本试验使用的供体细胞取自3-4月龄雄性绵羊耳皮肤。染色体分析表明,75.9%的第12代成纤维细胞为二倍体,表明本实验所用的第4-10代细胞满足克隆的要求。2.体外成熟18,20和24 h的卵母细胞的去核率无统计学差异,去核率均在80%以上。3.分别对两种激活方案作了研究。结果表明,离子霉素+放线菌酮处理组的卵裂率,桑/囊胚率,囊胚率分别为84.7%,25.5%和5.2%;而A23187+6-DMAP处理组的卵裂率,桑/囊胚率,囊胚率分别为63.2%,18.7%和2.2%。离子霉素+放线菌酮处理组的卵裂率显著高于A23187+6-DMAP组（P＜0.05）,但两种激活方案对桑/囊胚率及囊胚率无显著差异。4.以IVM 20 h的卵母细胞为受体胞质时,重构卵的融合率为51.2%,卵裂率为70.8%,受胎率为5.6%;而以IVM 22-24 h的卵为受体胞质时,重构卵的融合率为77.4%,卵裂率为84.7%,受胎率为12.1%。表明IVM 22-24 h比IVM20 h的卵母细胞更适于克隆胚发育。二、早期克隆胚碎裂现象及其机制的初步探讨1.在相同融合条件和激活条件下,不同胚胎培养系统（CR1aa vs SOFaa）对早期克隆胚碎裂有明显影响。CR1aa系统导致的胚胎碎裂率为50.6%,显著高于SOFaa系统（19.2%,P＜0.05）。2.在CR1aa培养系统中,不同融合电压对早期胚胎碎裂无明显影响。使用180 V/mm,20μs的脉冲刺激与140V/mm,20μs的脉冲刺激分别引起50.6%和45.0%的胚胎碎裂,二者无统计学差异。3.在较低融合电压（140V/mm）条件下,不同浓度离子霉素引起的早期胚胎碎裂有显著差异。使用5.0μM离子霉素可使44.6%的胚胎发生碎裂,显著高于2.5μM处理组（29.7%,P＜0.05）。4.在SOFaa系统中,不同激活方法（离子霉素联合放线菌酮,A23187联合6-DMAP）对早期克隆胚胎碎裂率无显著差异。分别为21.3%和16.5%。5.在SOFaa系统中,不同离子霉素浓度（5.0μM和2.5μM）对早期克隆胚胎碎裂率无显著差异,分别为22.0%和19.1%。三、结论1.采用IVM22-24h的卵母细胞作为受体胞质,可以显著提高重构胚的融合率及卵裂率,更有利于绵羊体细胞克隆胚的发育。2.绵羊体细胞核移植胚胎早期碎裂现象较为普遍,且发生频率会随不同实验方案的组合而发生变化。3.CR1aa系统在离子霉素联合放线菌酮方法激活条件下,比SOFaa系统更易引起克隆胚胎早期碎裂。4.SOFaa相对于CR1aa培养系统更适合于绵羊克隆胚的体外发育。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 引言
• 参考文献
• 第一部分 研究论文
• 第一章 绵羊耳皮肤成纤维细胞的培养
• 前言
• 1. 材料与方法
• 2. 试验结果
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第二章 绵羊体细胞核移植研究
• 前言
• 1. 材料与方法
• 2. 试验结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 参考文献
• 第三章 绵羊克隆胚早期碎裂研究
• 前言
• 1. 材料与方法
• 2. 试验结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 参考文献
• 第二部分 文献综述
• 哺乳动物核移植研究进展
• 1. 核移植研究历史
• 2. 哺乳动物核移植中相关机理研究进展
• 3. 体细胞核移植中的不同方案
• 4. 核移植技术的应用前景
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文