论文摘要
生物分子在生物体内的新陈代谢中起着重要的作用,它们的含量和活性直接关系到生物体的健康,因此对它们的分析在疾病的早期诊断和治疗等方面具有十分重要的意义。本论文基于分子信标技术实时、快速、简便的特点,结合连接酶对辅酶的高度依赖性,以三磷酸腺苷（ATP）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）、肌酸激酶（CK）、蛋白激酶A（PKA）为目标,着眼于发展生物分子检测的新方法,开展了以下四个工作:1.分子信标技术用于肌酸激酶活性的检测二磷酸腺苷（ADP）与磷酸肌酸在肌酸激酶催化作用下生成肌酸和ATP,由于T4 DNA连接酶对ATP的高度依赖性,T4 DNA连接酶就会识别并利用生成的ATP进行DNA连接反应,产生的长链DNA将分子信标打开,使荧光信号增强,达到间接检测肌酸激酶活性的目的,线性范围为1 50 U/L,检测下限为0.64 U/L。还用此方法考察了药物对CK活性的影响。该方法快速、简便、灵敏度高。2.分子信标技术用于蛋白激酶A活性的检测以蛋白激酶A为模型,通过测定蛋白激酶催化后所剩余的ATP的量来检测蛋白激酶的活性。T4 DNA连接酶和分子信标底物被用于ATP的检测,线性范围为12.5 150 nM,检测下限为1.25 nM。随后考察了药物染料木素对蛋白激酶A的抑制作用。该方法不用进行同位素标记、操作简便、具有通用性。3.分子信标结合酶信号放大检测ATP结合连接酶、腺苷酸激酶和核苷二磷酸激酶对ATP进行了检测。连接反应消耗ATP生成一磷酸腺苷（AMP）,AMP与三磷酸脱氧胞苷酸（dCTP）在腺苷酸激酶的催化下生成ADP和2-脱氧胞苷5-二磷酸（dCDP）,ADP和dCTP在核苷二磷酸激酶催化下生成ATP,使得ATP得到循环。利用T4 DNA连接酶对ATP的高度依赖性,ATP的不断产生使得被打开的分子信标不断增加,检测的线性范围为0.01 10 nM,检测下限为5 pM,与生物发光法的灵敏度相当。4.基于分子信标的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）高灵敏检测方法利用大肠杆菌DNA连接酶对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的高度依赖性进行NADP的检测。首先利用碱性磷酸酶（CIAP）将NADP的磷酸根切除转化生成NAD,然后将NAD加入到分子信标连接体系中进行检测,通过记录并计算荧光增强的初速度来定量,检测的线性范围为5 200 nM,检测下限为2 nM。这是一种简单、快速、高灵敏度的NADP分析新方法,且具有良好的特异性。