论文摘要
恶性胶质瘤是一种最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,常规治疗的效果均不理想,目前还没有非常有效的治疗方法。近年来,随着分子生物学、分子遗传学的发展,基因治疗的研究发展较快,为恶性胶质瘤的治疗开辟了新的道路。白细胞介素24（interleukin-24,IL-24）是白介素10细胞因子家族中的新成员,最初发现IL-24基因在终末分化的人类黑色素瘤中高度表达,因此也被称为黑色素瘤分化相关因子-7（melanoma differentiation-associated gene-7,mda-7）基因。研究发现IL-24对人多种肿瘤细胞（包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等）均有选择性抑制作用,因此成为基因治疗的候选基因。此外,IL-24与化疗、放疗相结合的研究亦有报道,比如Nishikawa于2001年首先报道将IL-24基因转染入人非小细胞肺癌的细胞后,可增强此肿瘤细胞对放射治疗的敏感性,而同时接受照射的人正常成纤维细胞则未受此放射线照射的影响。Chada也报道:对于人乳腺癌细胞,IL-24和放疗、化疗相结合后有协同和增效作用。本研究应用载有IL-24基因的新型重组腺病毒（Ad5F35-IL24）感染人胶质瘤细胞系U251和胶质瘤组织,并与化疗药替尼泊甙进行联合干预研究,观察IL-24基因对胶质瘤细胞在体外和体内的影响以及IL-24与化疗药卫盟联合作用是否相互协同增效,并探讨其可能的作用机制。第一部分Ad5F35-IL24重组腺病毒的构建目的:构建重组腺病毒Ad5F35-IL24。方法:先用HindIII和SalI双酶切ATCC质粒,得到目的条带,然后再用HindIII和SalI双酶切pDC316质粒,得到线性化的载体条带,接着进行片断连接,转化,筛选得到重组的pDC316-IL24质粒。随后用PCR和酶切的方法对重组pDC316-IL24质粒进行鉴定,经过此两者鉴定可能正确的IL-24重组质粒在全自动核酸分析仪上进行序列测定。接着制备感受态细胞,进行转化,随后大量制备质粒DNA;之后用双质粒共转染293细胞,同源重组产生重组腺病毒Ad5F35-IL24,再用PCR方法对其鉴定。然后进行病毒扩增、纯化,再用PCR方法对其鉴定后,按照公式:VP/ml=OD260×1.1×1012进行滴度测定。结果:成功构建成载有IL-24基因的重组pDC316-IL24质粒,并用PCR、酶切、序列测定和BLAST的方法进行了鉴定;获得了携带IL-24基因的大肠杆菌菌株;成功构建成载有IL-24基因的增殖能力缺陷的新型重组腺病毒Ad5F35-IL24,并进行了扩增和纯化,且用PCR的方法进行了鉴定;并按照公式:VP/ml=OD260×1.1×1012测定了病毒的滴度,其滴度为2.8×1011vp/ml。结论:构建成载有IL-24基因的增殖能力缺陷的新型重组腺病毒Ad5F35-IL24,其滴度为2.8×1011vp/ml。第二部分白细胞介素24抑制胶质瘤细胞生长的体内外实验研究目的:观察IL-24基因对在体外和体内胶质瘤细胞的影响,并探讨IL-24基因对胶质瘤的治疗作用及其可能的作用机制。方法:先原代培养人胎脑星形胶质细胞,然后用载有人白细胞介素24cDNA的新型重组腺病毒（Ad5F35-IL24）感染人胎脑星形胶质细胞和人胶质瘤细胞系U251,体外观察Ad5F35-IL24对它们生长的影响;建立人胶质瘤动物模型,瘤内注射Ad5F35-IL24,观察肿瘤生长情况;用流式细胞仪检测细胞和组织的凋亡及其Bax/Bcl-2的表达情况。结果:Ad5F35-IL24感染人胎脑星形胶质细胞、U251细胞和肿瘤组织后IL-24蛋白高表达,人胎脑星形胶质细胞的生长未受到明显抑制（P>0.05）,U251细胞和组织的生长受到明显抑制（P<0.05）,其凋亡率明显升高（P<0.05）,Bax/Bcl-2也明显升高（P<0.05）。结论:白细胞介素24具有选择性抑制人胶质瘤细胞系U251生长和诱导凋亡作用。Ad5F35-IL24转导白细胞介素24基因可能是一种有效的胶质瘤基因治疗途径。第三部分白细胞介素24在体内外抑制胶质瘤细胞生长的机制实验研究目的:探讨IL-24基因抑制胶质瘤细胞生长的可能的作用机制。方法:先用MTT法检测加入2-氨基嘌呤后U251细胞的抑制率,再用流式细胞仪检测加入2-氨基嘌呤后U251细胞的凋亡率和Bax/Bcl-2蛋白的表达情况,接着再用western blot检测加或未加2-氨基嘌呤的U251细胞和各组肿瘤组织中IL-24蛋白、一些信号蛋白如PKR、p-PKR、p38-MAPK、p-p38-MAPK、促凋亡蛋白BAX和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况。随后用免疫组织化学染色检测各组肿瘤组织的血管密度和bFGF、VEGF的表达情况。结果:通过Western Blot发现:IL-24对U251的选择性诱导凋亡作用可能是通过上调并激活其PKR蛋白（P<0.01）,随后又激活p38MAPK途径而实现的。接着又通过应用2-AP阻断了PKR蛋白的激活后,其下游p38MAPK的激活和凋亡也被阻断,这进一步证实了其作用机制。通过免疫组化技术,发现IL-24治疗组的微血管生成明显减少（P<0.05）,且其VEGF和bFGF表达也明显减少（P<0.05）。结论:IL-24选择性的抑制U251细胞和胶质瘤生长的机制是通过上调并激活PKR蛋白,随后又激活p38MAPK途径而实现的。IL-24还可抑制胶质瘤微血管生成,进而抑制肿瘤增殖。其机制可能与IL-24诱导胶质瘤组织中VEGF和bFGF表达的减少有关。第四部分白细胞介素24对胶质瘤细胞化疗敏感性影响的体内外实验研究目的:观察IL-24与化疗药卫盟联合作用是否相互协同增效,并探讨其可能的作用机制。方法:先用MTT法检测IL-24和替尼泊甙联合干预后的U251细胞抑制率,再用Hochest33258法检测其凋亡率,接着用流式细胞仪检测其Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。随后用Western blot分析IL-24和替尼泊甙联合干预后的U251细胞的IL-24、PKR、p-PKR、p38-MAPK、p-p38-MAPK、Bcl-2、BAX蛋白表达水平。还采用TUNEL法测定各组肿瘤组织的凋亡情况,再用流式细胞仪检测其Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。接着用免疫组织化学染色检测各组肿瘤组织的血管密度和bFGF、VEGF的表达情况。结果:通过MTT法发现IL-24和替尼泊甙联合干预组U251细胞的抑制率明显增高（P<0.001）,通过Hochest33258法和TUNEL法发现联合干预组U251细胞和肿瘤组织的凋亡率也明显增高（P<0.001）,通过流式细胞技术发现联合干预组U251细胞和肿瘤组织的Bax/Bcl-2升高（P<0.05）,通过Western Blot发现联合治疗组的PKR蛋白的表达和活化以及其下游的靶分子p38MAPK的表达和活化都明显增高（P<0.001）。通过免疫组化技术,发现联合治疗组的微血管生成明显减少（P<0.05）,且其VEGF和bFGF表达也明显减少（P<0.05）。结论:IL-24和替尼泊甙对U251细胞和胶质瘤具有协同杀伤和诱导凋亡的作用,其机制与IL-24诱导凋亡通路有关,还可能与促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的比例的升高有关。此外,联合治疗还可抑制胶质瘤微血管生成,进而抑制肿瘤增殖。其机制可能与IL-24诱导胶质瘤组织中VEGF和bFGF表达的减少有关。实验证明:IL-24和卫盟联合治疗胶质瘤是可取的治疗方案。