食品中常见致病菌的可视芯片检测技术研究

论文摘要

食品安全是全球性重大战略问题,不仅涉及到消费者的健康,而且关系到一个国家经济的正常发展,关系到社会的稳定和政府的威望。当前,食源性致病菌污染是食品安全的首要问题,迫切需要研究开发各种快速便捷的致病菌检测技术,因此本研究以可视芯片技术为基础,以常见的食源性致病菌的特异性序列为检测目标,建立了一套新型致病菌可视芯片检测技术。针对沙门氏菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌O157:H7型、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、阪崎肠杆菌和铜绿假单胞菌等常见的食源性致病菌,分别以23S rDNA基因序列和致病菌特异性基因序列为靶序列,设计引物和探针,并利用所设计的引物扩增致病菌DNA。将扩增产物回收测序,再与设计的引物和探针序列进行比对,分析所设计引物的扩增效果。将11种特异性探针连同阳性对照一起点到空白芯片上,制成致病菌检测用的可视芯片,并与经过特异性引物PCR扩增的模版DNA进行杂交,杂交后与辣根过氧化酶抗体反应,成功杂交的位点会在金黄色的背景上产生明显的蓝色圆点,而没有杂交反应发生的位点则与背景颜色相同。借此可以判断探针是否与PCR扩增产物发生特异性的结合,从而确定该模版DNA中是否有相应的致病菌。在对PCR产物进行了实验和分析后发现,rDNA基因保守性相对较强,并不能达到致病菌种间甚至血清型间鉴定的要求,而特异性基因序列种间差异较大,特异性明显,其结果在致病菌鉴定上具有较高的可信性,因此本论文选择特异性序列为引物和探针设计的目标序列。利用特异性探针制成的可视芯片,在杂交反应后均在金黄色背景下显示对应的蓝色杂交位点,杂交结果清晰明确,特异性强,背景污染低。通过多次实验证明该芯片实验操作简便,反映耗时少,实验结果可靠,具有很好的稳定性和重复性。芯片检测灵敏度可达到8.5×101 cfu/mL,如经过过夜增菌反应灵敏度可低至0.4 cfu/g。本实验建立了一套致病菌可视芯片检测技术。该技术可以一次检测出2个属和9个种的常见致病菌,且实验表明该技术灵敏、高效、准确、简便、高通量、实用性强,并摆脱了基因芯片在杂交结果分析阶段对荧光扫描仪的依赖,杂交结果明显直观。为致病菌的检验提供了新的思路和方法。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 微生物污染对食品安全的影响
• 1.2 常用食源性致病菌的检测技术
• 1.2.1 传统生化鉴定方法
• 1.2.2 免疫学方法
• 1.2.3 PCR 法
• 1.2.3.1 多重PCR 法
• 1.2.3.2 定量PCR 法
• 1.2.4 基因芯片方法
• 1.3 可视芯片技术及其应用前景
• 1.4 本研究的目的及意义
• 1.5 研究思路
• 1.5.1 研究目标
• 1.5.2 研究内容
• 1.5.3 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 生物信息学资料
• 2.1.2 实验菌株
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 食源性致病菌引物和探针的设计
• 2.2.1.1 利用16s rDNA 序列设计通用引物
• 2.2.1.2 利用23s rDNA 序列设计通用引物
• 2.2.1.3 利用特异性基因片段设计特异性引物
• 2.2.2 食源性致病菌引物的PCR 扩增
• 2.2.2.1 引物与探针的合成
• 2.2.2.2 细菌培养及DNA 的提取
• 2.2.2.3 细菌DNA 提取结果检测
• 2.2.2.4 PCR 扩增及结果观察
• 2.2.2.5 PCR 产物的回收与测序
• 2.2.3 可视芯片检测方法的建立
• 2.2.3.1 芯片点样及后处理
• 2.2.3.2 芯片杂交反应
• 2.2.3.3 探针点样条件确定
• 2.2.3.3.1 阳性对照点样浓度的确定
• 2.2.3.3.2 最适探针点样浓度的确定
• 2.2.3.4 可视芯片的制备
• 2.2.3.5 探针特异性实验
• 2.2.3.6 菌液检测灵敏度实验
• 2.2.3.7 添加模拟污染实验
• 3 结果与分析
• 3.1 食源性致病菌引物和探针的设计
• 3.1.1 16S rDNA 序列比对结果分析
• 3.1.2 23S rDNA 序列分析及通用引物的设计
• 3.1.3 利用特异性基因片段设计引物
• 3.2 食源性致病菌引物的PCR 扩增
• 3.2.1 细菌培养及DNA 的提取结果
• 3.2.2 23S rDNA 通用引物扩增及测序结果分析
• 3.2.3 特异性序列设计的引物扩增结果
• 3.3 可视芯片检测方法的建立
• 3.3.1 阳性对照点样浓度的确定
• 3.3.2 探针点样浓度实验结果
• 3.3.3 探针特异性实验结果
• 3.3.4 菌液检测灵敏度实验结果
• 3.3.5 添加模拟污染实验结果
• 4 讨论
• 4.1 特异性引物和探针的设计与筛选
• 4.2 可视芯片点制中的质量控制
• 4.3 芯片杂交结果的判定标准及背景污染的去除
• 4.4 进一步研究方向
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 攻读学位期间发表论文情况