牛分枝杆菌感染巨噬细胞THP-1全基因表达谱变化与北京昌平结核分枝杆菌基因分型

论文摘要

牛结核病（bovine tuberculosis）是由牛分枝杆菌（Mycobacterium boris M.bovis）和结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis M.TB）等结核分枝杆菌复合群引起的一种慢性消耗性传染疾病,其主要表现为牛生产力明显下降、乳房炎和结核性胸膜炎等症状。牛结核病在世界各国均有发生,在我国依然是最常见的多发性疾病之一,国际兽医局（OIE）将其列为B类动物疫病。同时牛结核病又是一种人畜共患性疾病,可以通过吸入含菌气溶胶或食用受污染的乳制品而从牛传染到人;此外,人又可以通过呼出含菌气溶胶而传染给牛。因此其传播和流行严重地影响着畜牧业、食品业持续发展和人类健康。准确的检测并淘汰分枝杆菌感染牛是控制结核病的关键所在,寻找可用于牛结核病免疫学诊断的后选靶标仍然是研究牛结核病防控的热点。一牛分枝杆菌感染巨噬细胞THP-1全基因表达谱变化本研究以牛分枝杆菌（AF2212/97）和结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis（H37Rv））感染人的模式巨噬细胞（THP-1）,采用含有22000个基因全长的基因芯片分析感染72个小时后的THP-1细胞全基因组的在转录水平的表达谱变化。在确定所分析的芯片的特异性和稳定性均达到要求的基础上,通过GO显著性统计分析,研究表达变化的基因所对应蛋白的分子功能,生物过程以及细胞组分;进一步采用Pathway显著性统计分析,研究表达差异蛋白之间的相互作用。结果感染H37Rv后的THP-1细胞,存在290个差异基因表达,其中170个上调表达,120个下调表达,与以往的结果类似。牛分枝杆菌感染的THP-1细胞中有1899（8.6%）个基因差异表达,其中1075个基因被上调表达（56.6%）,其它43.4%被下调。1899个基因中1674个在GenBank有记录,263个是新基因,基质金属蛋白酶12（H200000442）被上调达60.5倍;下调幅度最大的蛋白丝氨酸/半胱氨酸抑制酶（H200006177）被下调6.29倍。这些基因对应的多为炎症因子蛋白、凋亡蛋白、细胞外基质蛋白、T细胞受体信号通路相关蛋白等。其中与炎症相关的的蛋白有47个,如TNF、IL8、CXCL3、CCL8、CCL7、IFNK、IL-26、CCL28等。该工作为牛结核病发病机制及其诊断研究提供大量有益的生物学信息。二北京昌平结核分枝杆菌基因分型本研究以北京市昌平区的337株临床结核菌株作为实验菌株。构建了间隔区寡核苷酸（Spoligotyping）和Real-time PCR分型方法,对结核菌进行初步鉴定确定北京基因型结核分枝杆菌和非北京基因型结核分枝杆菌。结果299株为北京基因型Spoligotyping图谱（含类北京基因型）,依据北京/W系结核分枝杆菌定义,其占全部菌株的88.7%（299/337）。采用Real-time PCR方法,依据RD105为靶标分析337株结核分枝杆菌。其中缺失RD105的北京/W系结核分枝杆菌为299株,占全部菌株的88.7%（299/337）。RD181的非典型北京菌株为47株（15.7%）,而相对现代的缺失RD181的典型北京家族菌株为252株（84.3%）。在典型北京家族菌株中,RD150和RD142缺失的菌株分别为168株和173株。运用两种系统分型方法对北京基因型谱系及典型和非典型北京基因型的定义结果基本一致（一致率为99.09%）,而且Real-time PCR的分型速度更快捷,操作更方便,证明此新方法的可行性、准确性和便捷性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 1 前言
• 2 牛分枝杆菌基因组学
• 2.1 牛分枝杆菌与结核分枝杆菌的单核苷酸多态性序列的比较（Single Nucleotide Polymorphisms SNP）
• 2.2 牛分枝杆菌细胞膜和蛋白抗原的分析
• 2.3 牛分枝杆菌的基因调控
• 2.4 牛分枝杆菌基础代谢的研究
• 3 牛分枝杆菌在结核分枝杆菌复合群系统进化中的位置
• 4 牛分枝杆菌感染巨噬细胞的研究
• 5 分枝杆菌的基因分型及分子流行病学
• 参考文献
• 第二章 牛分枝杆菌感染巨噬细胞THP-1全基因表达谱变化的研究
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌株和培养
• 2.2.2 细胞株及感染实验
• 2.2.3 Zihel-Neelsen（Z-N）染色
• 2.2.4 THP-1细胞RNA的提取
• 2.2.5 甲醛变性胶电泳检测
• 2.2.6 对样品RNA进行荧光标记
• 2.2.6.1 反转录合成1st-strand cDNA
• 2.2.6.2 合成2nd-strand cDNA
• 2.2.6.3 体外转录合成cRNA
• 2.2.6.4 随机引物反转录
• 2.2.6.5 cDNA用KLENOW酶标记
• 2.2.7 DNA芯片的构建
• 2.2.8 杂交与清洗
• 2.2.9 芯片图像的采集与数据分析
• 2.2.9.1 采用LuxScan3.0图像分析软件（Capitalbio公司）对芯片图像进行分 析
• 2.2.9.2 差异表达基因筛选
• 3 结果
• 3.1 牛分枝杆菌菌落空斑形成单位计数
• 3.2 Ziehl-Neelsen（Z-N）染色
• 3.3 提取THP-1细胞系总RNA的结果
• 3.4 利用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪（CapitalBio公司）进行芯片扫描
• 3.5 THP-1细胞对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌入侵产生的表达谱差异
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 北京市昌平区结核分枝杆菌基因分型
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 结核分枝杆菌Spoligotyping的分型结果
• 2.2 Real-time PCR基因分型的结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 附录