白花蛇舌草含药血清对SMMC-7721人肝癌细胞的生长和分化的影响及机制研究

论文摘要

目的:中草药对肿瘤的防治作用研究已经成为肿瘤治疗的新的热点领域。白花蛇舌草具有清热解毒,活血化瘀,利水消肿及抗肿瘤的作用。实验研究表明,白花蛇舌草的有效成分熊果酸有抗突变,抗促癌,抗氧化,抗血管生成和诱导癌细胞分化等抗肿瘤活性,白花蛇舌草的另外一个有效成分齐墩果酸可以抑制多种实体移植瘤的生长。本研究旨在探讨抗肿瘤中药白花蛇舌草对人肝癌细胞SMMC—7721的生长和分化的影响及其可能的机制。为肝脏肿瘤的中医药治疗提供理论和实验依据。方法:采用血清药理学方法,应用光、电镜、免疫组织化学、流式细胞仪分析等分子生物学技术和方法,观察白花蛇舌草含药血清对人肝癌细胞株SMMC—7721人肝癌细胞的生长曲线、细胞分裂指数、细胞抑制率、细胞周期、细胞集形成率、组织细胞超微结构、AFP.P53.bcl-2.CyclinD1和Ki—67蛋白的表达,评价白花蛇舌草对SMMC—7721的诱导分化作用和机制。结果:白花蛇舌草含药血清对SMMC-7721人肝癌细胞形态学上具有影响作用,对照组SMMC-7721人肝癌细胞贴壁生长良好,细胞为上皮样形态,卵圆形,多边形或星形等不规则形态。核分裂像多见,核/浆比例倒置,核异型明显,HE染色细胞着色不均匀。处理组中10%含药血清组细胞1d～7d形态与对照组相似,随着含药血清浓度的增大,细胞形态向正常方向逆转明显,培养液中细胞排列疏松,贴壁细胞外观比对照组圆。20%,30%含药血清组SMMC-7721细胞形态学差异不大,细胞体积比10%浓度组大,细胞质更加丰富,核浆比例低,细胞核相对较小。但是贴壁细胞的数量随浓度的增加而明显减少。胞质较丰富,HE染色着色均匀一致。电镜观察对照组SMMC-7721人肝癌细胞超微结构,可见SMMC-7721细胞生长良好,细胞表面微绒毛突起较多,细胞内含有丰富的糖原,而游离的核糖体多,这些形态显示来源于上皮组织。处理组SMMC-7721人肝癌细胞细胞培养48小时后,超微结构都发生了明显的变化,表现为,细胞体积增大,形状变规则,不规则的形态的细胞数量减少,多呈卵圆形或近似圆形,细胞核质比例明显减小,细胞器增多等类似向正常肝细胞转变的趋向。同时,生长曲线显示,对照组SMMC-7721人肝癌细胞细胞增殖速度最快,当接种细胞数为2×104/ml时,连续计数至第七天,平均细胞数是40.98×104/ml,是接种细胞的20.27倍。不同剂量的白花蛇舌草含药血清连续诱导第七天后,SMMC-7721人肝癌细胞的生长状态受到了不同程度的抑制,其中,10%浓度组的细胞计数平均为21.02×104/ml,为初始细胞数量的10.32倍,细胞的生长抑制率达到49.52%（P＜0.05）。20%含药血清组连续诱导第七天,细胞减少到了16.59×104/ml,是初始接种浓度的8.35倍,细胞生长抑制率达到58.65%,与对照组相比较,具有显著性差异（P＜0.05）,而经过30%含药血清处理的SMMC-7721人肝癌细胞,细胞计数的结果是16.13×104/ml,细胞数是初始接种的8.026倍,细胞生长抑制率高达60.28%（P＜0.05）.在细胞集落形成率方面,对照组SMMC-7721人肝癌细胞具有较强的集落形成能力,细胞集落数目较多,均值高达45.87个/cm2,经过三种不同浓度含药血清诱导处理后的SMMC-7721细胞停止诱导作用后一周,观察细胞生长,仍然处于抑制;10%含药血清处理组细胞集落形成的数目是31.76个/cm2,集落形成抑制率达到34.61%,与对照组相比,差异显著（P＜0.05）,其细胞集落体积变小,多数细胞处于铺展状态或伸出胞质突起,30%浓度组细胞集落形成数目为27.6个/cm2,抑制率达到43.17%（P＜0.05）,20%含药血清组细胞集落形成能力介于两者之间。集落数目下降为30.73个/cm2。在细胞分裂指数方面,细胞的分裂指数测定结果显示,SMMC-7721人肝癌细胞具有旺盛的生长能力,在接种后的第四天分裂指数最大,为37.28‰,在处理组中,不同的时间点,分裂指数均有下降,但仍已第四天最为明显。与对照组相比,处理组SMMC-7721分裂指数下降明显,分裂指数为16.32‰,两组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞仪检测细胞周期发现,对照组SMMC-7721细胞G1期细胞比例为52.2%,S期比例为23.6%,G2期比例为24.2%,经不同浓度百花蛇舌草含药血清处理的SMMC-7721细胞周期均出现明显的G1期阻抑现象。其中10%含药血清组细胞即发生G1期阻抑,G1期细胞比例由52.2%上升到70.6%;而S期细胞比例由23.6%下降为20%;G2期细胞比例由24.2%下降为9.4%。提示产生G1期阻抑。第2天、第3天结果更明显。与对照组相比,20%含药血清组处理的SMMC-7721细胞第1d,G1期细胞比例略有增加,占57.9%;随着诱导时间的增加G1期为71.7%,而S期的细胞比例略有增加;细胞明显被阻滞于G1期。30%含药血清组G1期阻滞现象更加明显:G1期细胞比例高73.4%,S期、G2期细胞比例进一步减少,与中剂量组,低剂量组相比,G1期阻滞现象更加明显,提示存在量效关系。30%含药血清组同时可见凋亡峰,提示其同时具有促进凋亡,抑制增殖作用。白花蛇舌草含药血清对SMMC-7721细胞AFP表达的影响方面,对照组胞质中表达最强,随机5个高倍视野阳性细胞数大于75%,评4分;颜色强度为棕褐色,评3分;根据评分标准,其综合评分为11—12分,呈强阳性（+++）表达。10%含药血清组随机5个高倍视野阳性细胞数在26%-50%,评2-3分;颜色强度为棕色,评2分;根据评分标准,其综合评分为4—6分,呈中等阳性（++）表达。20%含药血清组随机5个高倍视野阳性细胞数在26%-50%,颜色强度为黄色,根据评分标准,其综合评分为3—4分,呈弱阳性（+）表达。30%含药血清组随机5个高倍视野阳性细胞数在26%-50%,颜色强度为黄色,根据评分标准,其综合评分为3—4分,呈弱阳性（+）表达。提示白花蛇舌草含药血清能下调AFP表达。应用SP免疫组化检测各组SMMC-7721人肝癌细胞突变型P53蛋白（mtp53）表达的变化,mtp53蛋白主要位于细胞核,同时核周边略呈浅黄色,评分结果显示:对照组细胞内P53蛋白在细胞核表达最强,随机5个高倍视野阳性细胞数大于75%,评为4分,颜色强度为棕褐色,评3分,综合评分为11—12分,呈强阳性（+++）表达。白花蛇舌草含药血清组细胞中,P53蛋白表达明显降低,阳性细胞表达率在48小时后降为26%-50%之间,评分4-5分,颜色强度为棕黄色,评分2分,根据评分标准,综合评分4-5分,呈弱阳性（+）表达。Bcl-2蛋白主要分布于细胞核周边的细胞质中,同时核上也有不少反应产物分布。评分结果显示,对照组细胞核内的Bcl-2在细胞质和细胞膜上表达最强,随机5个高倍视野阳性细胞数大于75%,评为4分,颜色强度为棕褐色,评3分,综合评分11—12分,呈强阳性（+++）表达。白花蛇舌草含药血清组bcl-2蛋白表达明显减弱,随机5个高倍视野阳性细胞数大于26%-50%,评为2分,颜色强度为棕黄色,评3分,综合评分4—6分,呈弱阳性（+）表达。在细胞周期蛋白CyclinD1蛋白表达方面,CyclinD1在对照组中的表达最高,CyclinD1主要位于细胞核上,同时细胞质中也有不少分布,与核内抗原外溢有关。评分结果显示:对照组细胞随机5个高倍视野阳性细胞数大于75%,评为4分,颜色强度为棕褐色,评3分,综合评分11—12分,呈强阳性表达（+++）。处理组CyclinD1蛋白表达明显减弱,随机5个高倍视野阳性细胞数大于26%-50%,评为2分,颜色强度为棕黄色,评3分,综合评分4—6分,呈弱阳性（+）表达。提示白花蛇舌草含药血清能够降低CyclinD1蛋白表达。在观察白花蛇舌草含药血清对SMMC-7721人肝癌细胞Ki-67蛋白表达的影响时发现:Ki-67在SMMC-7721对照组肝癌细胞中的表达较高,呈强阳性反应,反应产物为褐色或黄褐色,Ki-67主要分布在肝癌细胞的细胞核中。阳性细胞可见细胞核染色为棕褐色或棕黄色。阳性细胞数大于75%。处理组细胞中SMMC-7721人肝癌细胞Ki-67表达明显降低,Ki-67的表达呈弱阳性,显色反应为浅黄色。阳性细胞数25%-50%之间。与此同时对照组的Ki-67指数为160.2±51.7,含药血清组的Ki-67指数均小于14。两组比较,P＜0.05,有统计学意义。提示处理能减少Ki-67表达。结论:白花蛇舌草含药血清具有抑制SMMC—7721人肝癌细胞生长增殖、降低细胞分裂指数、降低肿瘤细胞集落形成能力、阻滞细胞于G1期、使AFP.P53.bcl—2 CyclinD蛋白表达明显下降,具有确切的生长抑制作用;促进SMMC—7721人肝癌细胞在细胞形态和超微结构上向正常肝细胞分化的作用;其生长抑制作用的可能机制与下调突变型P53基因表达、下调抗凋亡bcl—2基因蛋白表达及下调细胞增殖核抗原Ki-67蛋白表达有关;其诱导分化作用的机制可能是阻止细胞周期于G0/G1期促进细胞DNA修复及诱导肿瘤细胞凋亡有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写及中英文对照
• 前言
• 第一部分 白花蛇舌草含药血清对肝癌细胞SMMC-7721生长及分化影响的实验研究
• 材料
• 方法
• 各项观察指标与方法
• 统计学分析
• 结果
• 讨论
• 第二部分 白花蛇舌草含药血清对SMMC-7721人肝癌细胞生长及分化影响机制研究
• 材料和方法
• 方法
• 统计学分析
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述一 天然药物诱导分化研究现状
• 综述二 白花蛇舌草抗肿瘤作用及其机制研究进展
• 致谢