济宁青山羊皮肤毛囊体外培养和基因表达差异研究

论文摘要

济宁青山羊是具有独特毛色和花形的羔皮用山羊品种,其主要产品是猾子皮、板皮和山羊绒。羔羊生后1-3天内屠宰后得到的猾子皮具有天然的色彩和花纹,毛色品质好,光润,皮板轻巧而美观。猾子皮所制的翻毛皮衣和帽领等在国际市场上极为畅销,享有盛誉。本研究主要采用组织学技术和差异显示反转录PCR（DDRT-PCR）等分子细胞生物学技术,对济宁青山羊的皮肤毛囊组织结构和基因表达差异进行了研究,研究结果有助于揭示动物毛囊器官的生长发育规律;并为揭示济宁青山羊猾子皮花纹品质的分子遗传机理奠定基础。本文首先以组织学方法,研究了济宁青山羊猾子皮和成年羊皮肤毛囊的组织学结构。结果表明:猾子皮的毛囊与表皮呈45度倾斜,密度较稀。成年羊皮肤初级毛囊的毛球较大,毛囊较粗长,具有汗腺、皮脂腺、竖毛肌等附属结构,毛干有髓质;次级毛囊的毛球较小,皮脂腺不发达或缺如,毛干没有髓质。比较了揉后小猾皮和大猾皮的品质和组织学结构特点。结果表明:小猾皮干皮重平均为88.75±11.33,比大猾皮（出生30-60日龄）的皮板（重159.83±10.72）轻薄;有花面积比例为67.84±2.97,明显高于大猾皮（60.00±7.39）,且优等的波浪花所占比例较高;单位皮重面积产率（14.83±1.49）亦高于大猾皮（12.98±0.61）。但是,小猾皮的抗张强度、撕裂强度、崩裂强度均不及大猾皮。大猾皮与小猾皮皮厚的差异极显著（P<0.01）;大猾皮各个部位皮厚的部位差差异不显著（P>0.05）;而小猾皮各个部位皮厚的部位差明显大于大猾皮,且差异显著（P<0.05）。济宁青山羊是生产猾子皮的一个专用品种,今后应加强该品种的选育和改良,增大羊的体型,提高猾皮总面积、波浪花的比例和皮板的物理机械指标,以便获得品质更好的猾子皮,进一步提高经济效益。进一步采用差异显示反转录PCR技术,研究了济宁青山羊胎儿期、小猾皮和大猾皮皮肤组织的基因表达差异,结果表明:8种引物组合在3个年龄段的青山羊皮肤组织中共扩增出482条清晰可辩的条带,其中,在三个发育阶段的皮肤组织中未发现“有或无”的差异表达条带;但发现了99条表达“强或弱”的差异表达片段,占总条带数的20.54%。若进一步对这些差异表达条带进行回收、杂交验证和克隆测序,则有望得到与毛囊生长发育相关的差异表达基因。采用三因子三水平的拉丁方正交试验设计（L9（34））方法,对比研究了无血清的Williams E培养基、无血清的DMEM培养基和添加10%FCS（胎牛血清）的DMEM培养基,及其在三种培养基中分别添加0、2ng/mL和10ng/mL三种不同浓度的血管内皮细胞生长因子（VEGF）和表皮细胞生长因子（EGF）时对成年羊毛囊体外培养的影响。将山羊的单根毛囊完整地从皮肤组织中分离出来,同时平行培养在9种培养基中,借助于倒置显微镜和目镜测微尺随时不断地观察毛囊生长的形态变化和测量毛根的长度。结果发现:山羊游离毛囊在9种培养基中均能很好地生长;但以无血清的培养基和在Williams E培养基的效果最好;分别和同时添加2%-10%的VEGF和EGF时可加快毛囊的生长;添加10%FCS和不添加细胞生长因子时毛囊也能生长,但生长速度较慢。本研究结果为揭示青山羊毛囊发育规律奠定了基础;为进一步揭示济宁青山羊花纹品质的遗传机理奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 济宁青山羊的种质特性和毛皮品质
• 1.1.1 济宁青山羊的种质特性
• 1.1.2 济宁青山羊的毛色花型和毛皮品质
• 1.2 动物毛和毛囊的结构及其功能
• 1.2.1 哺乳动物毛发的宏观结构
• 1.2.2 哺乳动物毛的组织学结构
• 1.3 哺乳动物毛囊的结构及其功能
• 1.3.1 毛囊的细胞组成
• 1.3.2 毛囊细胞的分化、发育和功能
• 1.4 动物毛囊的生长发育及其调控
• 1.4.1 动物毛发和毛囊的生长发育周期
• 1.4.2 动物毛囊生长发育周期的转化及其调控
• 1.5 毛囊和毛发干细胞
• 1.6 毛色及其遗传基因
• 1.7 影响济宁青山羊猾子皮花纹品质的主要因素
• 1.8 研究基因差异表达的相关分子生物学技术
• 1.9 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂及来源
• 2.1.4 常用试剂的配制
• 2.1.5 提取总RNA 的主要试剂
• 2.1.6 反转录的主要试剂
• 2.1.7 DDRT-PCR 的主要试剂
• 2.1.8 非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳及银染的主要试剂
• 2.1.9 快速银染试剂
• 2.1.10 组织切片的主要试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 青山羊皮肤组织的RNA 提取、纯化与质量检测
• 2.2.2 反转录
• 2.2.3 DDRT-PCR
• 2.2.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳及银染
• 2.2.5 RT-PCR 产物检测体系的优化
• 2.2.6 差异表达片段的回收、验证和假阳性片段的快速剔除
• 2.2.7 皮肤毛囊的石蜡切片
• 2.2.8 羊毛分析
• 2.2.9 毛囊器官的体外培养和影响因素研究
• 2.2.10 实验数据的统计分析方法
• 3 结果与分析
• 3.1 小猾皮和大猾皮的品质分析
• 3.2 济宁青山羊成年羊的皮肤组织学结构
• 3.3 济宁青山羊毛囊的形态结构
• 3.4 青山羊皮肤组织总RNA 提取和差显技术优化
• 3.5 青山羊皮肤组织的差异显示研究结果
• 3.6 青山羊毛囊器官的体外游离培养
• 3.7 不同培养基对山羊游离毛囊体外生长速度的影响
• 3.8 细胞生长因子 EGF 和 VEGF 对体外培养的山羊毛囊生长速度的影响
• 4 讨论与结论
• 4.1 关于小猾皮和大猾皮的品质分析
• 4.2 关于济宁青山羊毛囊的结构与形态发生
• 4.3 关于济宁青山羊皮肤组织的差异显示研究结果
• 4.4 山羊毛囊体外游离培养的条件优化
• 4.5 不同培养基对山羊毛囊培养的影响
• 4.6 VEGF 和EGF 对体外培养的山羊毛囊生长的影响
• 5 结论
• 5.1 小猾皮和大猾皮各有特点
• 5.2 皮肤组织三个不同发育阶段的差异显示研究结果
• 5.3 优化建立了毛囊器官体外游离培养方法
• 5.4 不同培养基和细胞因子对体外培养的毛囊有显著的影响
• 参考文献
• 致谢