联用技术在生物分子检测中的应用

论文摘要

金属蛋白是一种以金属离子作为辅因子的结合蛋白质,在生物体细胞内起着重要作用。作为一种重要的金属蛋白,其分子质量较低,半胱胺酸残基和金属含量高,结构高度保守。金属硫蛋白在生物体内有重要的生物学意义,它参与了必需金属的平衡代谢、重金属解毒以及清除体内自由基等过程。为了快速准确地检测金属硫蛋白（MT）,我们采用了紫外-可见分光光度法和伏安法联用技术检测MT。MT样品和具有亲电子性质的二硫化物DTDP（4,4-二硫代联吡啶）混合后,在载液的推动下,依次通过紫外-可见分光光度计和电化学流动池检测MT中巯基和金属离子。通过联用技术,单独技术不能消除的不确定性大大减小,联用技术可以准确快速的检测MT,并且有利于其生理学的研究。MicroRNA在各种生命活动中具有重要的作用,特别是在肿瘤发生和发展中。我们将流动注射和表面等离子体激元共振技术（SPR）联用,用于检测人体中存在的低浓度miRNA,生物素标记的miRNA （biotin-miRNA）能够被辣根过氧化物酶／抗生蛋白链菌素（SA-HRP）特异性结合,HRP生物催化双氧水（H2O2）氧化四氯萘酚（4-CN）产生沉淀,从而引起SPR角急剧变化,而microRNA样品通过竞争作用取代biotin-miRNA在芯片表面的位点,芯片表面的SA-HRP数量随之降低,通过竞争反应原理,可对miRNA进行检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 金属硫蛋白（MT）的定义和分类
• 1.2 金属硫蛋白的结构
• 1.2.1 金属硫蛋白的一级结构
• 1.2.2 金属硫蛋白的空间结构
• 1.3 金属硫蛋白的功能
• 1.3.1 结合金属
• 1.3.2 抗氧化
• 1.4 金属硫蛋白的检测
• 1.4.1 间接检测
• 1.4.2 直接检测
• 1.5 生物标志物microRNA
• 1.5.1 microRNA的简介
• 1.5.2 microRNA的形成及其作用机制
• 1.5.3 microRNA的功能及意义
• 1.5.4 microRNA和肿瘤
• 1.6 表面等离子体激元共振技术
• 1.6.1 基本原理
• 1.6.2 SPR共价偶联生物分子
• 1.6.3 SPR技术在生物化学领域中的应用
• 1.7 本论文研究目的和设想
• 第二章 紫外-可见分光光度法和电化学联用技术对MT中巯基和金属连续检测
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 化学试剂
• 2.2.2 仪器设备
• 2.2.3 溶液的配制
• 2.3 实验过程
• 2.3.1 玻碳电极的预处理
• 2.3.2 电极表面修饰
• 2.3.3 流动体系,连续进样装置的安装
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 紫外可见分光光度法检测波长的选择
• 2.4.2 金属离子和半胱氨酸的表征
• 2.5 小结
• 第三章 生物标志物miRNA的SPR检测
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 药品与试剂
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 溶液的配制
• 3.2.4 实验所使用SPR仪器装置图
• 3.2.5 玻片处理及金膜制备
• 3.2.6 仪器校正
• 3.3 实验过程
• 3.3.1 miRNA的表面固定
• 3.3.2 竞争杂交过程以及酶的组装
• 3.3.3 酶-放大检测
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 检测原理
• 3.4.2 Dextran、胱氨浓度的选择
• 3.4.3 HRP催化沉淀可行性试验
• 3.4.4 BSA减小非特异性吸附
• 3.4.5 不同浓度biotin-miRNA的SPR检测
• 3.5 总结
• 3.6 展望
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果