论文摘要
课题背景:随着社会发展的加快,竞争压力逐步增大,人类疾病谱发生了很大的变化,各种因社会、心理或行为因素所致疾病急剧上升,心理过度应激导致的精神类疾病层出不穷。神经精神疾病在我国疾病总负担中排名首位,约占疾病总负担的20%。根据世界卫生组织推算,中国神经精神疾病负担到2020年将上升至疾病总负担的1/4。有资料显示,我国70%的人处于亚健康状态,与心理应激相关的疾病患者约占人群的5%～10%,身心疾病、心理障碍已成为多发病、常见病。而精神疾病中排名首位的一般是神经症,主要表现为焦虑症、强迫症、恐惧症、神经衰弱等。目前,对心理疾病及心理应激的基础和临床研究已经成为医学研究重要课题之一。中医在情志疾病治疗方面积累了丰富的经验,《内经》时期即有情志疗法、针灸疗法,后世医家进一步丰富和发展为脏腑病机治法,创立了许多行之有效的方药。桑螵蛸散见于《本草衍义》,为调补心肾、涩精止遗名方,对恐惧所致的心肾两虚证有良好治疗效果。本课题立足于中医七情学说,采用经典条件反射恐惧模型,运用电化学—高效液相法检测下丘脑单胺类神经递质及其代谢产物,放射免疫方法检测ACTH、CORT、IL-2和IL-8。通过对边缘系统三大递质能神经元作用的对比,以及联系神经—内分泌—免疫网络系统的整体作用,来揭示恐惧发生的可能机制及中药调节的深层机理。实验方法:1、雄性Wistar大鼠,体重180-220g,随机分为三组:正常对照组、恐惧模型组、孤独饲养组,每组8只大鼠。恐惧模型组大鼠单独饲养于不锈钢笼（50cm×30cm×20cm）中,自由饮食饮水,饲养10天,第11天13∶30将大鼠单独放入光电刺激仪（30cm×40cm×40cm）,四周为玻璃,底部铺设铜栅,通以1mA交流电,顶部置10W日光灯);前5min为适应期,后同时给予电击和闪光,每次1S,间隔1min,共30min。第12,13天重复实验。第14天实验只予光照,不予电击,摄像记录第6～30min内大鼠行为变化,同时记录动物处于冻结状态的时间。行为评定采用盲法,三位观察者观看录像评分。实验结束立即放入旷场实验箱内,进行应激后行为学检测。孤独饲养组大鼠于同样环境下孤独饲养13天,第14天13∶30摄像记录大鼠行为变化,并对其行为学进行评分,14∶00放入旷场实验箱内,进行应激后行为学检测。正常对照组大鼠予以群居饲养,自由饮食饮水,第14天进行行为学测定及旷场实验。实验第14天,所有动物旷场实验后麻醉,断头处死,取血,离心制备血清,肝素抗凝离心制备血浆,-20℃冻存。方法按照放射免疫试剂盒说明进行操作,检测血浆ACTH水平、血清CORT、IL-2、IL-8含量。2、雄性Wistar大鼠,体重180-220g,随机分为三组:正常对照组、恐惧模型组、模型给药组,每组8只大鼠。恐惧模型组造模方法同前,模型给药组于电击实验前3天桑螵散水煎液灌胃,每日1次,每次2ml,连续给药3天。正常动物组大鼠群居饲养,自由饮食饮水。实验第14天,所有动物麻醉,断头处死,取出下丘脑,匀浆,离心,通过高效液相色谱系统（HPLC）加电化学检测器（ECD）检测单胺类递质及代谢产物含量。统计学处理:实验结果用spss13.0统计软件分析,均用（?）±s表示,利用Pearson相关分析旷场两变量之间的关系,采用单因素方差分析方法（One-Way-ANOVA）进行多样本均数比较,若存在差异,采用Levene检验进行方差一致性检验,若方差齐时,用Least-significant difference（LSD）方法,若方差不齐时用Tamhane’sT2方法。P＜0.05被认为有显著性差异。主要结果:（一）大鼠行为学得分及旷场实验行为学得分恐惧应激大鼠的行为得分与正常对照组及孤独饲养组比较均有显著差异（F=72.582,P=0.000）,恐惧应激大鼠行为学得分高于正常对照组及孤独饲养组。正常对照组与孤独饲养组比较,无显著差异（P=0.153）。各组大鼠旷场实验水平得分、垂直得分、旷场总分均有显著差异（P＜0.01）。水平得分、垂直得分、旷场总分F值分别为23.893、52.371、40.963;P值均为0.000。恐惧模型组得分低于孤独饲养组和正常对照组,孤独饲养组得分高于恐惧模型组,低于正常对照组（P＜0.05）。对垂直得分及水平得分进行Pearson相关分析,Pearson相关系数r=0.730,P=0.000（双侧）,认为水平得分与垂直得分变量之间存在正相关关系。（二）ACTH、CORT水平比较各组大鼠ACTH、CORT均有显著差异（F值分别10.466、13.804;均为P＜0.01）。恐惧模型组和正常对照组血浆ACTH比较,有显著性差异（P=0.043）;与孤独饲养组血浆ACTH比较,有显著性差异（P=0.010）;恐惧模型组血浆ACTH水平高于正常对照组及孤独饲养组。恐惧模型组和正常对照组血清CORT有显著性差异（P=0.000）,与孤独饲养组血清CORT比较,亦存在显著差异（P=0.004）;恐惧模型组CORT水平显著高于正常对照组及孤独饲养组。孤独饲养组与正常对照组ACTH、CORT比较,无显著差异（均为P＞0.05）。（三）IL-2、IL-8水平比较各组大鼠IL-2未见显著差异（F=1.355,P=0.280）,各组大鼠IL-8比较,存在显著差异（F=3.489,P=0.049）,其中恐惧模型组与正常对照组IL-8有显著差异（P=0.015）,恐惧模型组血清IL-8水平高于正常对照组。孤独饲养组IL-8水平与恐惧模型组及正常对照组相较,均无显著差异（均为P＞0.05）（四）下丘脑单胺类神经递质含量比较恐惧模型组与正常对照组NE、E、DA、5-HT均有显著性差异（P值分别为0.022、0.000、0.000、0.023）,恐惧模型组NE、E、DA、5-HT含量均低于正常对照组;恐惧模型组与模型给药组在NE、E、5-HT方面存在显著差异（P值分别为0.001、0.007、0.009）,恐惧给药组NE、E、5-HT含量均高于恐惧模型组,DA水平两组未见显著差异（P=0.104）;正常对照组与模型给药组在NE、E、5-HT方面未见显著差异（P值分别为0.349、0.101、0.459）,DA水平存在显著差异（P=0.019）。（五）下丘脑单胺类神经递质代谢产物含量比较恐惧模型组与正常对照组MHPG、HVA存在显著差异（P值分别为0.004、0.032）,恐惧模型组MHPG、HVA含量低于正常对照组,DOPAC及5-HIAA两组间未见显著差异（P值分别为0.518、0.404）;恐惧模型组与模型给药组在MHPG、5-HIAA水平有显著差异（P值分别为0.002、0.005）,DOPAC及HVA两组间未见显著差异（P值分别为0.760、0.619）;正常对照组与模型给药组在HVA、5—HIAA水平有显著性差异（P值分别为0.011、0.034）,MHPG及DOPAC两组间未见显著差异（P值分别为0.826、0.482）。（六）递质与其代谢产物比值变化恐惧模型组与正常对照组在DA/DOPAC比值存在显著差异（P=0.000）,恐惧模型组DA/DOPAC比值低于正常对照组;正常对照组与模型给药组DA/DOPAC存在显著性差异（P=0.003）;5-HT/5-HIAA比值各组间比较未见显著差异（均为P＞0.05）。（七）递质间平衡关系5-HT/DA、NE/DA、5-HT/NE在各组比值无显著性差异（均为P＞0.05）。结论:一、依据经典条件反射原理,采用Takashi方法建立恐惧应激模型,在电击与光照之间建立联系,尽量降低躯体刺激的影响,同时在病因上力求符合中医情志内伤的原则,造模稳定性高,方法简单,可行性好。二、对恐惧应激模型进行大鼠行为学检测及应激后旷场行为学检测,量化评定,根据行为学得分及旷场实验分析,恐惧可减弱大鼠兴奋性及适应能力,这种表现与人的情绪反应有一定程度的相似性,说明此模型能够有效模拟人类恐惧情绪,是较为理想的中医情志内伤模型。三、恐惧应激可激活HPA轴,从而升高ACTH、CORT水平,恐惧应激模型组和正常对照组ACTH、CORT水平有显著性差异。四、恐惧应激对血清IL-2未见显著影响,各组大鼠IL-2未见显著差异;恐惧应激可导致血清IL-8水平升高,与正常对照组差异显著。五、恐惧应激可导致下丘脑NE、E、DA、5-HT含量降低,恐惧模型组与正常对照组NE、E含量有显著性差异。六、恐惧应激可导致下丘脑MHPG、HVA含量降低,恐惧模型组与正常对照组MHPG、HVA存在显著差异。七、恐惧应激可导致DA/DOPAC比值下降,恐惧模型组与正常对照组在DA/DOPAC比值存在显著差异。八、桑螵蛸散能升高下丘脑NE、E、5-HT含量水平至正常水平,抑制HPA轴活性,桑螵蛸散给药组与恐惧模型组NE、E、5-HT有显著性差异,正常对照组与模型给药组在NE、E、5-HT方面未见显著差异。综上实验结果表明:本实验根据中医七情理论,依据经典条件反射原理建立恐惧应激模型,以行为学指标进行评估,基本符合中医情志内伤的发病过程。恐惧模型组ACTH、CORT水平含量显著升高,表明恐惧应激可升高HPA轴活性,提高应激水平;恐惧模型组下丘脑NE、E、DA、5-HT含量显著降低,提示此类神经递质在恐惧应激中有重要作用。恐惧应激对血清IL-2水平无显著性差异,对IL-8有升高作用,恐惧应激对免疫功能的影响尚待进一步研究。桑螵蛸散能升高下丘脑NE、E、5-HT含量水平,发挥中枢调节保护作用。