六种食源性致病微生物PCR检测及固相化试剂盒的研究

论文摘要

食品安全是一个重大的世界性公共卫生问题,不仅影响到人们的健康,更是关系到国计民生的大事,越来越受到人们的重视,其中细菌性食物中毒是引起食源性疾病的主要因素。传统的细菌检测方法耗时长,操作繁琐,越来越不能满足实际检测的需要。本研究通过设计食源性致病微生物的特异性引物、DNA提取方法的优化、以及退火温度和Mg2+浓度等PCR主要反应条件优化后,建立了沙门氏菌（Salmonella spp.）、单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志贺氏菌（Shigella spp.）、大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）和蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的单重及多重PCR检测体系。扩增结果表明这6株致病菌均有清晰、特异的目标条带,经测序验证其同源性高达99%,DNA灵敏度可达pg级。因此,本研究建立的PCR检测体系特异性强、灵敏度高。同时以国标法为对照,对人为接种致病菌的牛奶样品、生牛肉以及市场采集的200份样品进行了检测。结果表明,采用多重PCR方法简单快速且灵敏度高,整个检测时间在24 h以内,在肉品中的检测灵敏度可达1 CFU/g。与国标法相比,应用多重PCR在200份样品检测中无假阴性,假阳性低于2%。建立的多重PCR方法可作为现有国家标准方法的有效补充,从而提高现有检测方法的准确性和敏感性。此外,本研究在建立了多重PCR方法的基础上,通过固相化技术,构建了多重PCR检测试剂盒,并对其性能进行了分析。集成的固相化试剂盒稳定性和实用性较好,可常温保存3个月以上而不影响检测效果,具有较大的应用价值,可推广应用于食品卫生检测以及临床检验等领域。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 1 绪论
• 1.1 概述
• 1.1.1 食品安全现状
• 1.1.2 食源性致病微生物造成的危害
• 1.1.3 本研究涉及的六种食源性致病微生物
• 1.1.4 食源性致病微生物检测的研究进展
• 1.2 研究目的
• 1.3 研究内容和技术路线
• 1.3.1 六种食源性致病微生物单重PCR 检测技术的研究
• 1.3.2 六种食源性致病微生物多重PCR 检测技术的研究
• 1.3.3 多重PCR 检测方法的应用与评价
• 1.3.4 六种食源性致病微生物PCR 检测试剂盒的构建
• 2 六种食源性致病菌单重PCR 检测技术的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 供试菌种
• 2.2.2 主要仪器设备
• 2.2.3 主要试剂及培养基
• 2.2.4 细菌DNA 提取方法的研究
• 2.2.5 特异性基因的选择及引物设计
• 2.2.6 单重PCR 体系的建立
• 2.2.7 单重PCR 灵敏度测定
• 2.2.8 模拟食品中的应用
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 细菌DNA 提取方法的优化
• 2.3.2 引物的特异性检测
• 2.3.3 PCR 产物测序结果
• 2.3.4 单重PCR 灵敏度测定
• 2.3.5 单重PCR 在人工感染食品检测中的应用
• 2.4 讨论
• 3 六种食源性致病菌多重PCR 检测技术的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 供试菌种
• 3.2.2 主要仪器设备
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 细菌DNA 的提取
• 3.2.5 多重PCR 体系的建立
• 3.2.6 多重PCR 灵敏度测定
• 3.2.7 人工感染食品中的应用
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 多重PCR 体系的优化
• 3.3.2 多重PCR 灵敏度测定
• 3.3.3 多重PCR 在人工感染食品检测中的应用
• 3.4 讨论与小结
• 4 多重PCR 检测方法的应用与评价
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要仪器设备
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 人工感染生牛肉的多重PCR 检测
• 4.2.4 食品样品验证试验
• 4.2.5 六种病原菌国标检测方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 人工感染生牛肉中多重PCR 检测灵敏度的测定
• 4.3.2 多重PCR 检测方法和国标方法对样品检测结果的比较
• 4.4 讨论与小结
• 5 六种食源性致病菌PCR 检测试剂盒的构建
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 供试菌种
• 5.2.2 主要仪器设备
• 5.2.3 PCR 检测试剂盒的构建
• 5.2.4 多重PCR 检测试剂盒性能的验证
• 5.2.5 多重PCR 检测试剂盒的应用
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 多重PCR 检测试剂盒特异性验证
• 5.3.2 多重PCR 检测试剂盒储存稳定性验证
• 5.3.3 应用检测效果的评价
• 5.4 讨论与小结
• 6 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录