论文题目: 酵母端粒酶核心酶的纯化和定性研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 廖新化
导师: 周金秋
关键词: 端粒酶,逆转录酶,端粒,重建,进行性,酵母
文献来源: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
发表年度: 2005
论文摘要: 端粒酶是一种特殊的逆转录酶,它能在体内延伸染色体单链末端,在体外延伸寡聚核苷酸。一般认为端粒酶的蛋白催化亚基和RNA亚基组成了核心酶,它们对体外活性是必需的。我们在芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae中共表达了GST融合的酵母端粒酶的蛋白催化亚基Est2p和RNA亚基Tlc1,重建了端粒酶的活性。我们用硫酸铵沉淀分级分离和亲和纯化方法部分纯化了GST-Est2p/Tlc1 复合体。通过质谱和Western杂交鉴定,这个纯化的复合体不包含内源的端粒酶全酶的另外两个亚基:Est1p和Est3p。纯化的Est2p/Tlc1 复合体在体外可以特异地有进行性地(processively)把核苷酸掺入到单链的TG1-3重复的引物上,但不能转位启动第二轮端粒重复序列的合成。当引物匹配在Tlc1 模板区的不同位置时,纯化的核心酶显示出不同的活性。我们建立的纯化和重建端粒酶核心酶的方法,可以用来进一步研究端粒酶全酶的其它亚基及其调控蛋白的调控机制。人们在端粒酶的催化亚基中鉴定出了逆转录酶结构域,这个结构域被认为是端粒酶的活性中心。我们发现从酵母表达系统中纯化的GST 融合的Est2p 和人的端粒酶催化亚基hTERT 样品在体外具有普通逆转录酶活性。当逆转录酶结构域中的关键氨基酸Asp670 突变为Ala 时,突变的Est2p 在体内不能互补野生型的Est2p 的功能,并且纯化的突变的端粒酶复合体的端粒酶活性完全丧失了。但是,纯化的突变的Est2p 和hTERT 的逆转酶活性和野生型的差不多。这提示酵母中可能还存在一种内源的与端粒酶催化亚基相互结合的蛋白提供了逆转录酶活性。此外,纯化的端粒酶催化亚基样品还具有DNA 聚合酶的活性。这些新的发现提示端粒酶催化亚基可能参与其它的细胞功能。鉴定Est2p 自身的逆转录酶活性以及相互结合蛋白的逆转录酶活性还需要进一步研究。
论文目录:
摘要
ABSTRACT
英文缩写
目录
第一章 引言
1.1 端粒和端粒酶的研究历史
1.2 酵母端粒酶
1.3 端粒酶的进行性
1.4 体外重建
1.5 逆转录酶
第二章 材料与方法
2.1 酵母菌株
2.2 质粒的构建
2.3 酵母est2△ rad52△单倍体菌株的构建
2.4 GST-Est2p和Tlc1(或者GST-hTERT和hTR)的共表达和亲和纯化(72)
2.5 蛋白的定量
2.6 端粒酶活性检测方法
2.7 RDDP(逆转录酶)和DDDP活性检测方法
2.8 Northern杂交
2.9 端粒长度Southern杂交实验
2.10 Tlc1 RNA的体外转录
2.11 Est2p的体外翻译
2.12 Est1p,Est2p和Est3p多克隆抗体的制备
第三章 结果
3.1 GST-Est2p和/或Tlc1 在酵母中的过表达
3.2 共同过表达GST-Est2p和Tlc1 能够重建端粒酶活性
3.3 GST-Est2p/Tlc1(或者hTERT/hTR)复合体的纯化
3.4 用质谱的方法鉴定与GST-Est2p/Tlc1 复合体相互结合的蛋白
3.5 重组的GST-Est2p/Tlc1 复合体能够合成一轮端粒重复序列
3.6 重组的GST-Est2p/Tlc1 复合体倾向于利用单链的Saccharomyces cerevisie端粒DNA底物
3.7 重组的GST-Est2p/Tlc1 复合体在引物匹配在模板不同位置的时候表现出了不同的活性
3.8 纯化的GST-Est2p样品具有RDDP和DDDP的活性
3.9 逆转录酶活性可能来自与端粒酶催化亚基相互作用的未知组分
3.10 逆转录酶结构域的置换在体内不能恢复Est2p的功能
第四章 讨论
第五章 参考文献
发表文章目录
获奖
致谢
发布时间: 2005-09-09
参考文献
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