一个亚洲棉不育矮秆突变体的分离鉴定及相关基因克隆

论文摘要

株高是棉花的一个重要性状,在棉花栽培中矮化对于塑造株形、提高产量具有重要作用,因此矮化育种一直是棉花育种的一个热点。本试验通过对矮秆突变体的遗传、解剖结构、生理生化方面的研究,旨在阐明矮杆表型的分子机制。本试验将来源于亚洲棉（Gossypium arboreum L.）品种金华中棉经60Co γ-射线照射后,分离、鉴定出一个新不育矮秆突变体,遗传分析结果显示不育矮秆表型可能是由一对隐性等位基因控制,因此,我们建议将不育矮秆突变体命名为sda。sda植株矮化是节间长度缩短与节间数减少两者共同作用的结果,扫描电镜观察结果表明节间长度与节间细胞数目有关。维管形成层的活动明显,次生组织比例大；次生木质部细胞木质化程度高；后生木质部导管数增加,且导管排列散乱；位于次生韧皮部与皮层之间的韧皮纤维十分明显。另外与野生型（WT）相比,sda植株吲哚-3-乙酸（IAA）与脱落酸（ABA）含量较低。而且,突变体叶片内的叶绿素含量与净光合速率明显降低。但是ABA生物合成或信号转导与sda表型形成可能有关。通过半定量RT-PCR分析检测到13条差异表达的ESTs,不育矮秆突变体表达水平降低,野生型表达水平增加。结合9个潜在的激素生物合成基因在IAA、ABA、多胺（PA）和茉莉酸（JA）合成中的作用对本研究结果进行了讨论。为确定吲哚乙酸生物合成基因色氨酸脱羧酶与腈水解酶在IAA变化中的作用,利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及快速扩增cDNA末端（RACE）从亚洲棉叶片中克隆到这两个基因。棉花TDC（GaTDC）全长包含148bp的5’非翻译区,一个含有1494bp的开放阅读框（ORF）,编码一条含有497个氨基酸的多肽,该多肽的分子量估计为54.898KD,和185bp的3’非翻译区。GaTDC编码的氨基酸序列与其它生物体TDC具有高度的同源性。通过实时定量PCR （qRT-PCR）试验检测到sda突变体叶片中GaTDC的mRNA表达水平低下。相对于野生型,突变体GaTDC表达下调。GaNIT cDNA序列全长为1502bp,它包括150bp的5’非翻译区,一个1053bp的开放阅读框,和299bp的3’非翻译区。编码的GaNIT预测为350氨基酸长,分子量计算值为37.943KD,等电点是5.19。发现在氨基酸水平棉花腈水解酶与已知的腈水解酶序列之间高度同源。利用qRT-PCR分析检测到它的mRNA转录本在突变体叶片中下调表达。本研究结果表明sda植株吲哚-3-乙酸（IAA）的含量低于野生型植株的吲哚-3-乙酸（IAA）,突变体内GaTDC表达和GaNIT表达减少。结果对探讨GaTDC和GaNIT在棉花IAA生物合成中的功能是有益的。根据编码玉米黄质环氧化酶（ZEP）的EST片段序列,利用RACE策略快速克隆到一个与黄化相关的新基因（EAG）全长cDNA,它编码包含FAD结合结构域和FHA结构域的蛋白质,用GaZEP表示。实时定量PCR结果显示突变体内GaZEP表达下调。对玉米黄质环氧化酶在叶黄素循环和ABA前体合成中的作用相关结果进行了讨论。采用PCR扩增与锚定PCR技术从亚洲棉中克隆了精氨酸脱羧酶（ADC）基因。棉花ADC（GaADC）全长cDNA包括474bp的5’非翻译区（UTR）,一个2181bp的ORF,编码726个氨基酸的多肽,估计该多肽的分子量为78.078KD,和382bp的3’非翻译区。GaADC编码的氨基酸序列与其它生物ADC具有高度的同源性。应用实时定量PCR （qRT-PCR）分析评估不同材料内GaADC的mRNA表达,检测到sda叶片中GaADC的mRNA表达水平低下。60Co γ射线照射后sda内GaADC的表达下调,结果表明GaADC可能为涉及植物衰老的一种蛋白质。为了充分证明核DNA出现的辐射损伤,本试验对60Co γ射线的特性和其辐射强度与种子损伤之间的关系做了进一步的研究。高剂量辐射对棉花、尤其是棉花基因组的直接影响没有得到充分的证明。将棉花种子暴露于剂量高达300Gy的60Co γ,辐射下,通过对DNA进行突变与缺失分析,采用SSR引物评估出现诱导的可能性,进行DNA测序分析鉴定诱导的点突变。序列分析表明γ射线诱导sda突变主要包括部分缺失与点突变。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一部分 文献综述
• 第一章 植物激素突变体研究进展
• 1 发现及鉴别
• 2 突变体的分类
• 3 突变体的遗传分析
• 4 激素突变体实例
• 4.1 赤霉素突变体
• 4.2 脱落酸突变体
• 4.3 生长素突变体
• 4.4 乙烯突变体
• 4.5 细胞分裂素突变体
• 5 激素矮化突变体
• 5.1 与GA相关的植物矮化突变体
• 5.2 与BR相关的植物矮化突变体
• 5.3 与IAA有关的植物矮化突变体
• 5.4 其他类型的植物矮化突变体
• 第二章 脱落酸与植物细胞凋亡研究进展
• 1 细胞凋亡概述
• 1.1 细胞凋亡与植物体发育、衰老的关系
• 1.2 细胞凋亡在植物抗病、抗逆反应中的作用
• 1.3 植物细胞凋亡机理
• 1.4 植物细胞凋亡研究的意义
• 2 脱落酸及其作用的分子基础
• 3 发育中的细胞凋亡与脱落酸
• 3.1 胚乳发育中的细胞凋亡与脱落酸
• 3.2 雄核发育中的细胞凋亡与脱落酸
• 4 脱落酸调控细胞凋亡的可能机制
• 第三章 植物基因克隆技术研究进展
• 1 差异表达基因分离技术
• 1.1 扣除杂交技术
• 1.2 差式筛选技术
• 1.3 差异显示PCR
• 2 转座子标签技术
• 3 图位克隆技术
• 4 同源序列技术
• 5 表达序列标签技术（EST）
• 本研究的目的与意义
• 第二部分 研究报告
• 第四章 一个不育矮秆突变体的发现与遗传分析
• 1 材料与方法
• a突变体产生'>1.1 sd^a突变体产生
• 1.2 遗传分析
• 1.3 激素测定
• 1.4 生理指标测量
• 1.5 半定量RT-PCR分析
• 1.6 统计分析
• 1.7 SSR标记测定与扩增子测序
• a突变体玉米黄质环氧化酶克隆'>1.8 sd^a突变体玉米黄质环氧化酶克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 由γ射线诱变产生的不育矮秆突变体
• 2.2 遗传分析
• a突变体的表型'>2.3 sd^a突变体的表型
• 2.4 不育矮秆植株内源激素与ESTs表达分析
• a植物与野生型生理指标比较'>2.5 sd^a植物与野生型生理指标比较
• 2.6 DNA缺失分析
• 2.7 GaZEP基因分子突变谱
• 3 讨论
• a突变体的多效性表型'>3.1 sd^a突变体的多效性表型
• a突变体中韧皮纤维形成加速和导管分子分化'>3.2 sd^a突变体中韧皮纤维形成加速和导管分子分化
• 3.3 生长素和ABA是棉花幼苗茎伸长必需的调节剂
• 60Coγ辐射对sd^a突变体基因组的影响'>3.4⁶⁰Coγ辐射对sd^a突变体基因组的影响
• 第五章 亚洲棉激素生物合成基因全长CDNA克隆与特征分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 棉花色氨酸脱羧酶分子克隆及定量RT-PCR
• 1.3 棉花腈水解酶分子克隆及定量RT-PCR
• 1.4 棉花玉米黄质环氧化酶克隆与基因表达分析
• 1.5 棉花精氨酸脱羧酶克隆与mRNA表达
• 2 结果与分析
• 2.1 棉花色氨酸脱羧酶cDNA
• 2.2 棉花腈水解酶cDNA
• 2.3 棉花玉米黄质环氧化酶cDNA的分离与特性
• 2.4 GaADC基因克隆与序列
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 致谢