人骨髓间充质干细胞早期和晚期间差异表达基因的鉴定

论文摘要

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）具有很强的自我更新能力,并具有很高的可塑性,在组织工程及临床细胞治疗等方面具有广阔的应用前景,所以间充质干细胞已成为干细胞研究的热点,如何在体外培养过程中维持MSCs未分化状态已成为其中的核心问题之一。而到目前为止对调节MSCs生长和未分化状态的分子机理方面的研究甚少。因此为了进一步了解维持MSCs未分化状态的机制,本论文采用自行建立培养的人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells, hBM-MSCs）克隆,应用抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization, SSH）结合半定量RT-PCR技术筛选和鉴定hBM-MSCs早期和晚期间差异表达的基因。本研究首先分离培养hBM-MSCs,再分别选取传代培养至第五代和第二十代的细胞作为实验方（tester）和驱动方（driver）,进行抑制消减杂交,构建cDNA消减杂交文库。然后将消减杂交后的PCR产物克隆到pGEM-T easy载体中,随后挑取阳性克隆进行测序,并与GenBank人基因库中已公布的核酸序列进行同源性比较分析。结果表明挑取的117个克隆分别代表21个已知的人基因,同源性都达到90%以上,这些基因分别具有不同的生物学功能。为进一步确定消减杂交的结果,进行半定量RT-PCR分析,结果发现21个基因中有6个基因在早期hBM-MSCs中的表达量都是晚期中表达量的2倍以上,它们分别是rab23,ddx21 ,tnfaip3 ,nomo2 ,pabpc3及cnn3,这些基因可能对维持hBM-MSCs的未分化状态和调节早期hBM-MSCs的生长具有重要作用。本研究将为这些基因的进一步功能研究以及阐明维持hBM-MSCs未分化状态的机制打下基础,而且有助于改变和控制hBM-MSCs的生长和分化的研究,进一步推动hBM-MSCs在组织工程上的应用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文中重要缩略词表
• 第1章 绪论
• 1.1 干细胞简介
• 1.1.1 干细胞的涵义
• 1.1.2 干细胞的分类
• 1.1.3 干细胞的生物学特性
• 1.1.4 干细胞研究的意义
• 1.2 间充质干细胞概述
• 1.2.1 间充质干细胞的来源及表型特征
• 1.2.2 间充质干细胞的生物学特征
• 1.2.3 间充质干细胞在医学上的应用前景
• 1.3 间充质干细胞自我更新和分化调控机制
• 1.4 抑制消减杂交技术
• 1.5 本研究的目的与意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料与常用设备
• 2.1.1 细胞培养试剂
• 2.1.2 细胞检测及分子生物学试剂
• 2.1.3 主要实验仪器与设备
• 2.2 人骨髓间充质干细胞的分离、培养及扩增
• 2.2.1 标本材料来源
• 2.2.2 人骨髓来源间充质干细胞的体外分离培养
• 2.2.3 骨髓间充质干细胞的传代培养
• 2.2.4 骨髓间充质干细胞的表型鉴定
• 2.2.5 骨髓间充质干细胞自我更新能力分析
• 2.3 早期和晚期骨髓间充质干细胞RNA的提取
• 2.4 双链cDNA 的合成
• 2.5 SSH法构建骨髓间充质干细胞传代早晚期的cDNA消减文库
• 2.5.1 RsaⅠ酶切
• 2.5.2 Tester双链cDNA两端接头的连接
• 2.5.3 杂交
• 2.5.4 PCR扩增反应
• 2.5.5 消减效率的PCR分析
• 2.5.6 消减后PCR产物的克隆
• 2.5.7 插入片段的PCR鉴定
• 2.5.8 阳性克隆的测序及同源性比对分析
• 2.6 半定量RT-PCR检测差异表达基因
• 第3章 结果
• 3.1 hBM-MSCs 培养
• 3.2 hBM-MSCs的表型鉴定
• 3.3 hBM-MSCs 自我更新能力分析
• 3.4 消减杂交
• 3.5 消减杂交文库分析
• 3.5.1 克隆及插入片断的鉴定
• 3.5.2 克隆测序及同源性比对分析
• 3.6 半定量RT-PCR分析差异基因的表达
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果