桑粒肩天牛幼虫肠道微生物多样性的分子生物学方法研究

论文摘要

桑粒肩天牛是是鞘翅目天牛科的一个很大的类群,一种重要的农业害虫,它们危害多种林木和木质产品。昆虫的肠道生活着大量的微生物,这些微生物和宿主相互作用,相互影响,对宿主的生长发育,营养代谢和疾病防御有着非常重要的作用。依靠纯培养技术为基础的传统的方法研究肠道微生物的多样性存在着很多的局限性,因为自然界超过99%的微生物,在现有的实验条件下都不能培养。而分子生物学的方法能够突破培养的瓶颈。本试验使用基于16S rDNA-PCR的变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE） ,限制性片段多态性分析（restriction fragment length polymorphism , RFLP）和均一化克隆文库技术研究桑粒肩天牛幼虫肠道微生物多样性。使用DGGE分析方法,从桑粒肩天牛肠道微生物的16S rDNA扩增片段切胶回收22个不同条带,经过分别测序,显示出它们属于15个属细菌。其中,一株不可培养的变形菌属菌株（Proteobacterium）和一株克雷伯氏菌属（Klebsiella）的细菌几乎都出现在检测的样品中。DGGE凝胶中最亮的两个条带分别被鉴定为芽孢杆菌属的菌株（Bacillus sp.）和克雷伯氏菌属菌株（Klebsiella sp.）。即通过DGGE图谱表现出来的优势菌为杆菌和克雷伯氏菌。DGGE图谱还反映了天牛肠道微生物的季节变化,夏季的肠道菌群较冬季更为丰富。同时,构建了一个传统的桑粒肩天牛幼虫肠道16S rDNA克隆文库和一个均一化16S rDNA克隆文库。用限制性酶切片段多态性（restriction fragment length polymorphism , RFLP）方法分析建立的传统克隆文库,根据不同的酶切指纹图谱将175个克隆子归为48个不同的分类操作单元（OTUs）。每个分类操作单元选择一个代表克隆子进行测序,通过比对,这48个OTUs分别属于22个不同的细菌属,其中的优势菌是来自克雷伯氏菌属（Klebsiella）,乳球菌属（Lactococcus）和肠球菌属（Entorococcus）的细菌,它们分别占所检测克隆总数的24.6%, 19.4%和17.1%。此结果显示,RFLP分析方法比DGGE分析方法具有更高的分辨率。均一化技术被首次用于环境中微生物多样性的研究。在克隆的均一化文库中,随机测序的82个克隆包含了79种不同的细菌,它们分别属于32个属,17个科和7个门或者亚门。其中,来自醋酸杆菌属（Acetobacter）,弓形杆菌属（Arcobacter）,短波单胞菌属（Brevundimonas）,氢噬胞菌属（Hydrogenophaga）,克吕沃尔菌属（Kluyvera）,泛菌属（Pantoea）, Grimontella和涅斯捷连科氏菌属（Nesterenkonia）等8个属的细菌在传统以RFLP方法分析的传统文库中和以DGGE直接分析的方法中都没有检测到。此外,由于用于分析的序列接近16S rDNA的全长,两个文库也提供了比直接的16S rDNA PCR扩增片段的DGGE分析更为详尽的生物多样性信息。使用CLUSTAL W和PHYLIP （version 3.67）等软件对所得到的序列进行多样性分析,发现在本实验中得到的部分菌群与基因库中已知菌群的系统发育关系较远,较为独特。三种分子生物学方法展示了桑粒肩天牛肠道中栖息着超过我们预料的丰富的微生物群体,总共有140多种,来自9个门,22个科和44个属。这个结果证明了直接提取DNA和扩增16S rDNA的分子生物学方法比传统的基于纯培养的方法能得到更多的微生物多样性信息。这三种分子生物学的方法可以相互补充,全面综合的揭示和阐述天牛肠道微生物菌群的结构和变化。均一化技术也被证实是一种行之有效的肠道微生物多样性的研究方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 桑粒肩天牛的危害情况
• 1.2 肠道微生物和昆虫的相互关系
• 1.3 肠道微生物研究现状
• 1.4 肠道微生物的鉴定方法
• 1.4.1 变性梯度凝胶电泳
• 1.4.2 限制性片段长度多态性分析
• 1.4.3 均一化技术
• 1.5 研究目的和研究内容
• 1.6 本研究的意义
• 1.7 创新之处
• 1.8 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试昆虫
• 2.1.2 主要试剂和实验仪器
• 2.2 肠道的制备和肠道总DNA 的提取
• 2.3 DGGE 分析肠道微生物
• 2.3.1 PCR 扩增肠道微生物16S rDNA V3 区
• 2.3.2 溶液的配制
• 2.3.3 凝胶的灌制和电泳
• 2.3.4 DGGE 凝胶上条带的回收测序
• 2.3.5 基因序列的上传
• 2.4 桑粒肩天牛幼虫肠道微生物16S RDNA 常规克隆文库的构建及RFLP 分析
• 2.4.1 PCR 扩增16S rDNA
• 2.4.2 常规16S rDNA 克隆文库的构建
• 2.4.3 转化子的RFLP 分析和测序
• 2.4.4 克隆文库的分析
• 2.4.5 基因序列的上传
• 2.5 均一化文库的构建
• 2.5.1 PCR 扩增和PCR 产物的纯化
• 2.5.2 16S rDNA 的均一化
• 2.5.3 均一化文库的构建
• 2.5.4 文库序列的分析和上传
• 3 结果与分析
• 3.1 桑天牛天牛幼虫肠道微生物总DNA 的提取方法比较
• 3.2 天牛肠道微生物多样性DGGE 指纹图谱分析
• 3.3 常规 16S rDNA 克隆文库 RFLP 分析
• 3.4 天牛肠道微生物 16S rDNA 均一化克隆文库的分析
• 4 讨论
• 4.1 分子生物学方法在环境生物多样性分析中有着重要的作用
• 4.2 三种分子生物学方法的差异
• 4.3 菌群来源和功能分析
• 5 结论与后续工作建议
• 5.1 结论
• 5.2 后续工作建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录