论文摘要
目的研究HBV对肝癌细胞中Raf1表达的影响,并对其作用机制进行初步探讨,为揭示HBV相关的HCC的发生机制提供一种新的思路。方法1.用RT-PCR和Western blot检测Raf1在HepG2细胞和HepG2.2.15细胞中的表达差异。2.构建Raf1基因的启动子虫荧光素酶报告质粒,将构建好的启动子虫荧光素酶报告质粒转染HepG2细胞检测启动子活性,然后将启动子虫荧光素酶报告质粒分别与HBV表达质粒共转染HepG2细胞,利用双荧光素酶报告系统,检测HBV对启动子活性的影响;利用Western blot检测HBV对Raf1蛋白表达的影响。3.将构建好的HBs、HBp、HBc及HBx表达质粒,分别与Raf1启动子虫荧光素酶报告质粒共转染HepG2细胞,利用双荧光素酶报告系统,检测HBV哪种蛋白对启动子活性影响最明显。并进一步利用Western blot检测上述蛋白对Raf1蛋白表达的影响。4.设计干扰质粒,干扰HBV中对启动子活性影响最为明显的蛋白的表达。将设计好的干扰质粒转染HepG2.2.15,利用RT-PCR检测干扰质粒的干扰效果;利用Western blot检测干扰质粒对Raf1表达的影响。结果1. RT-PCR结果显示,Raf1在HepG2.2.15细胞中的表达量是其在HepG2细胞中的2.16倍,Western blot结果显示Raf1在HepG2.2.15细胞中的表达量比其在HepG2细胞中表达量明显增加。2.成功构建了Raf1启动子的虫荧光素酶报告质粒,证明了该启动子有明显活性。将Raf1启动子的虫荧光素酶报告质粒与HBV表达质粒共转HepG2细胞时,发现HBV能提高荧光素酶活性4.65倍（与对照相比）。3.用HBV四种表达蛋白与Raf1转染转HepG2细胞时,发现HBs和HBx对Raf1启动子活性影响最为明显,相对荧光素酶活性分别是对照组的3.62倍和2.92倍,而HBc、HBp对启动子活性没有影响。与此同时,Western blot检测也发现转染了HBs和HBx表达质粒转HepG2细胞时中,Raf1的蛋白表达水平与对照组相比明显增加。4.转染了HBs和HBx干扰质粒的HepG2.2.15细胞中HBs和HBx的表达量明显下降,且此两种质粒分别转染时,对其余三种蛋白的表达没有影响。Western blot检测证明转染了HBs和HBx干扰质粒后,Raf1的蛋白表达水平明显与对照组相比明显降低。结论HBV能通过增强Raf1启动子活性增加其在HepG2.2.15细胞中的表达,其中HBs和HBx蛋白起主要作用。本研究揭示了HBV引起HCC的一种新的途径,为治疗HBV相关的HCC提供新的建议。
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