论文摘要
本文围绕微生物代谢过程开展研究，首先构建大肠杆菌中心碳代谢网络，然后以代谢平衡分析（Flux BalanceAnalysis，FBA）方法为基础，选取E.coli1.1566及有代表性的中心碳代谢途径单基因敲除大肠杆菌进行考察，包括△sdhAB、△ackA-pta基因敲除大肠杆菌。在MATLAB6.1环境下，应用CellNetAnalyzer软件计算，以最大比生长速率（μ）为优化目标函数求解。通量值以胞外碳水化合物进入胞内的速率为标准进行归一化，得到野生型大肠杆菌胞内中心碳代谢途径的通量分布，以及敲除不同基因大肠杆菌与野生型的代谢通量对比。并通过代谢通量分析考察了这些单基因敲除对大肠杆菌代谢的影响，借以了解各菌株的主要代谢特征。为客观反映微生物细胞代谢物组的真实情况，建立快速微生物代谢淬灭（quenching）方法和标准化胞内代谢物提取方法，同时建立基于气相色谱和质谱联用的细菌胞内代谢物分析方法。研究利用不同有机溶剂快速淬灭细胞代谢活动的能力，筛选不同萃取方案对微生物细胞代谢物提取效率的差异，通过析因分析筛选出对细胞淬灭效果有显著影响的有机溶剂冷乙腈，同时为了提高硅烷化衍生效率，对GC-MS衍生条件也作了进一步的优化，结果表明：冻干后的胞内代谢物中加入50μL吡啶，超生10min溶解后，再加入60μL BSTFA+1%TMS，75℃水浴45min，使提取到的代谢物种类较多且总量较大。为“全组分”指纹分析提供可靠的前提条件，为进一步代谢途径分析打下了基础。对苯二甲酸（PTA）是一种重要的化工原料，为了研究生物催化对二甲苯（PX）生成对苯二甲酸（PTA）的代谢途径，建立了对苯二甲酸、对甲基苯甲醛、对甲基苯甲醇、对甲基苯甲酸的高效液相色谱分析方法。采用Hypersil SAX阴离子交换柱，流动相为2.5mol/LNH4H2PO4含10%的乙腈溶液，pH4.32，流速0.8mL/min，柱温30℃，紫外检测波长为254nm。在此色谱条件下，各组分在7min内得到很好的分离，回收率符合含量测定要求。运用该方法测定睾丸酮丛毛单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌生物催化生成对苯二甲酸不同发酵时间发酵液中主要代谢物含量，并结合GC-MS方法检测胞内代谢物，包括有机酸、氨基酸、糖及长链脂肪酸等，分析了睾丸酮丛毛单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌协同作用催化对二甲苯生成对苯二甲酸的代谢途径。