过量合成5-氨基乙酰丙酸工程菌的构建

论文摘要

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid ALA）是一种光动力化合物。在医学上,ALA用于癌症的光动力学治疗和诊断,具有促进血红素生成的作用,是痤疮治疗的外用药,并且可以作为生发剂使用；在农业上,ALA是一种绿色无公害的除草剂、杀虫剂、抗微生物药剂和植物生长促进剂,具有促进植物生长,对害虫、致病菌高效,对人畜无毒、对环境无污染等优点,在生物农药和肥料领域具有广泛的应用前景。与化学合成法相比生物合成法生产ALA,工艺简单,生产原料低廉,可减少环境污染。基于生物合成法的优势及ALA广泛的应用前景,本论文主要对5-氨基乙酰丙酸的生物合成展开研究,包括ALA合成酶基因（hemA）的克隆、表达,工程菌发酵条件的优化以及运用代谢工程原理和技术构建具有新的ALA生物合成途径的大肠杆菌工程菌。主要实验结果如下：（1）从筛选得到的光合菌中,克隆了ALA合成途径中的关键酶ALA合成酶的基因（hemA）,测序结果表明该基因长度为1224 bp。与NC007493 USA Rhodobacter sphaeroides进行比对,发现有一个碱基的差异（第1204位点由C突变为T）,一致性为99.92%。将基因序列翻译为氨基酸序列进行比对,有一个氨基酸的差异（第335位由丙氨酸变为缬氨酸）,一致性为99%（2）构建了原核表达载体pET30a-hemA,转化至宿主菌E.coli BL21（DE3）中,进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测结果显示,pET30a-hemA诱导后表达出的蛋白分子量约为45 kDa,与理论相对分子质量（44.7 kDa）相符,说明该蛋白诱导表达成功。（3）对pET30a-hemA/E.coli BL21（DE3）的发酵培养基和培养条件进行了优化,确定了最优培养基为TB培养基,最佳诱导温度为16℃,同时添加前体物质甘氨酸和琥珀酸终浓度均达到100 mM有助于菌体生长和ALA的合成,ALA的产量达到528 mg/L。（4）采用代谢工程策略,以大肠杆菌为宿主,系统考虑ALA C4生物合成途径的限速步骤、前体供给及产物分泌等问题,对ALA合成酶基因（hemA）、辅酶A转移酶基因（Cat）以及ALA分泌基因（YBi）进行基因操作,借助pETDuet-1共表达载体,构建了一株共表达hemA、Cat和YBi基因的工程菌E.coli ACY,胞外ALA的产量达到1124mg/L。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 本课题研究的背景及意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 5-氨基乙酰丙酸简介
• 1.2.2 5-氨基乙酰丙酸的产生菌
• 1.2.3 5-氨基乙酰丙酸的代谢途径
• 1.2.4 5-氨基乙酰丙酸的合成方法研究进展
• 1.2.5 5-氨基乙酰丙酸的应用领域
• 1.3 本论文研究内容
• 第2章 ALA生物合成关键酶基因的克隆及表达载体的构建
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养条件
• 2.1.3 工具酶和主要试剂
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Rhodobacter sphaeroides基因组的提取
• 2.2.2 引物设计与hemA目的基因的扩增
• 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.4 DNA的纯化回收
• 2.2.5 克隆载体pEASYT-hemA的构建
• 2.2.6 原核表达载体pET30a-hemA的构建
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 目的基因hemA的扩增结果
• 2.3.2 克隆载体的构建与重组子的鉴定
• 2.3.3 表达载体的构建与重组子的鉴定
• 2.4 本章小结
• 第3章 ALA合成酶基因在E.coli中的诱导表达及条件优化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 培养条件
• 3.1.3 工具酶和主要试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 重组质粒pET30a-hemA在E.coli BL21（DE3）中的诱导表达
• 3.2.2 工程菌发酵条件的优化
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 重组质粒pET30a-hemA在E.coli BL21（DE3）中的诱导表达
• 3.3.2 培养基的优化
• 3.3.3 诱导温度的影响
• 3.3.4 前体的影响
• 3.4 本章小结
• 第4章 5-氨基乙酰丙酸C4生物合成途径工程菌的构建
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株与质粒
• 4.1.2 培养条件
• 4.1.3 工具酶和主要试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 ALA C4生物合成途径相关基因的克隆
• 4.2.2 DNA切胶回收
• 4.2.3 克隆载体的构建
• 4.2.4 共表达载体pETA、pETAC、pETACY的构建及诱导表达
• 4.2.5 RT-PCR验证基因的转录
• 4.2.6 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.2.7 5-氨基乙酰丙酸的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 目的基因hemA、Cat、YBi的克隆
• 4.3.2 克隆载体的构建及重组子的鉴定
• 4.3.3 共表达载体pETA、pETAC、pETACY的构建
• 4.3.4 hemA、Cat、YBi的转录与表达
• 4.3.5 共表达hemA和Cat以及hemA、Cat和YBi对ALA产量的影响
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间所发表的论文
• 致谢