酵母细胞酶法催化合成谷胱甘肽研究

论文摘要

谷胱甘肽是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同时具有γ-谷氨酰基和巯基的三肽化合物,这两种结构是谷胱甘肽许多重要生理功能的基础,如γ-谷氨酰胺键参与氨基酸的转运；甘氨酸和半胱氨酸残基参与胆酸的代谢；分子中的巯基参与中和自由基解毒等重要生理功能,在食品工业和医药中具有重要的应用前景。本文主要研究内容如下：1.实验收集培养了9株酵母菌,分别测定他们的细胞生物量和胞内谷胱甘肽（GSH）含量,酿酒酵母SP004细胞干重达到11.39g/L,啤酒酵母TS013胞内GSH含量达到1.5282mg/g wet cells;验证考察了4种不同提取方法对细胞内GSH含量测定的影响,结果表明,温差破碎法提取效果较好。同时比较9株酵母菌催化合成GSH的能力,结果显示,絮凝酵母SP5GSH合成酶系活力相对较高,酶活达到2.385mg/g湿细胞,每克湿细胞催化前体AA合成GSH转化率为7.76%。2.用单因素试验考察不同反应液体积与菌体量比、硫酸镁浓度、磷酸钾缓冲液浓度、葡萄糖浓度、反应温度以及振荡反应速度对絮凝酵母SP5细胞催化前体AA合成GSH的影响；正交试验分析法研究不同反应液体积与菌体量比、硫酸镁浓度、磷酸钾缓冲液浓度以及葡萄糖浓度4个因素的交互作用。结果表明,合成GSH的适宜条件为：谷氨酸60mmol/L、半胱氨酸20mmol/L、甘氨酸20mmol/L、七水合硫酸镁20mmol/L、葡萄糖0.5mol/L、pH7.0磷酸钾缓冲液100mmol/L,30℃下,200r/min,振荡反应时间6h。在此条件下,絮凝酵母SP5细胞GSH合成酶系活力平均达到2.9498mg/g湿细胞,每克絮凝酵母SP5湿细胞催化前体AA合成GSH的转化率平均为9.60%,比初始反应条件下的AA转化率提高了23.68%。3.通过单因素实验,分析了培养温度、发酵培养基起始pH值、摇瓶装液量、接种量、发酵培养基碳源、有机氮源以及无机氮源7个因素对絮凝酵母SP5细胞生物量以及催化合成GSH的影响；正交试验分析发酵培养基碳源、有机氮源以及无机氮源这三个因素的交互作用,确定了较优的发酵条件如下：培养温度30℃,起始pH值7.0,摇瓶装液量20%（250mL锥形瓶）,接种量5%,培养基组成：蔗糖30g/L,蛋白胨25g/L,硫酸铵5g/L,KH2P041.5g/L,MgS04·7H200.5g/L,肌醇0.1g/L,在此条件下絮凝酵母SP5催化前体AA合成GSH的转化率达到10.98%,比初始条件下转化率提高了14.38%。4.为改善絮凝酵母SP5细胞通透性,提高其催化合成GSH的转化率,实验采用Triton X-100、Tween80. SDS三种不同的表面活性剂,分别配制成浓度为0.01%、0.1%、1%的溶液,考察细胞通透性对催化合成GSH的影响,实验结果表明1%浓度的Triton X-10030℃处理2h时效果较好,对其浓度及时间做进一步优化后,0.5%浓度的Triton X-10030℃下处理2h效果较好,此条件下絮凝酵母SP5催化前体AA合成GSH的转化率达到14.65%,比未经过表面活性剂溶液处理的酵母细胞转化率提高了33.42%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本论文中缩略语注释
• 第1章 绪论
• 1.1 概述
• 1.1.1 谷胱甘肽的结构组成及性质
• 1.1.2 谷胱甘肽的生理功能
• 1.1.3 谷胱甘肽的应用价值
• 1.2 谷胱甘肽的生产方法
• 1.3 酶法合成谷胱甘肽存在的问题
• 1.3.1 菌株的选择
• 1.3.2 ATP再生系统
• 1.4 课题来源与研究意义
• 1.4.1 课题来源
• 1.4.2 研究意义
• 1.5 本课题研究内容
• 第2章 高产谷胱甘肽活性酵母菌的筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 细胞生物量比较
• 2.2.2 胞内GSH含量比较
• 2.2.3 提取方法对酵母菌细胞内GSH含量测定的影响
• 2.2.4 酵母细胞催化前体AA合成GSH能力比较
• 2.3 本章小结
• 第3章 正交试验法优化前体AA合成GSH反应条件
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 不同菌体量对催化合成GSH的影响
• 3.2.2 硫酸镁浓度对催化合成GSH的影响
• 3.2.3 磷酸钾缓冲液浓度对催化合成GSH的影响
• 3.2.4 葡糖糖浓度对催化合成GSH的影响
• 3.2.5 反应温度对絮凝酵母催化合成GSH的影响
• 3.2.6 振荡反应速度对絮凝酵母催化合成GSH的影响
• 3.2.7 葡萄糖消耗与前体AA转化率随反应时间变化
• 3.2.8 正交试验设计和结果
• 3.3 本章小结
• 第4章 絮凝酵母SP5发酵条件对细胞催化合成GSH的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 发酵温度的影响
• 4.2.2 发酵培养基起始pH值的影响
• 4.2.3 摇瓶装液量的影响
• 4.2.4 接种量的影响
• 4.2.5 发酵培养基碳源的影响
• 4.2.6 发酵培养基氮源的影响
• 4.2.7 碳源氮源正交试验
• 4.3 本章小结
• 第5章 表面活性剂对细胞合成GSH的影响
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 Triton X-100溶液对酵母细胞催化合成GSH的影响
• 5.2.2 Tween 80溶液对酵母细胞催化合成GSH的影响
• 5.2.3 SDS溶液对酵母细胞催化合成GSH的影响
• 5.2.4 表面活性剂Triton X-100透性化酵母细胞条件优化
• 5.3 本章小结
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 进一步工作方向
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果