鸭ADSL与PurH基因序列特征及表达与肌肉肌苷酸（IMP）含量的相关性分析

论文摘要

肌苷酸（IMP, inosine monophosphate acid）是畜禽肉中重要的风味物质,目前国际上把IMP含量作为衡量肉质鲜味的一项重要指标。在动物体内,IMP从头合成共涉及十步反应,其中腺苷琥珀酸裂解酶（ADSL, adenylosuccinate lyase）是催化第八步反应的酶,也是合成IMP过程中的关键酶之一。PurH（ATIC）是具有氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶（AICARTfase）（EC 2.1.2.3）和次黄嘌呤核苷酸环水解酶（IMPCH）（EC3.5.4.10）催化活性的双功能酶,催化肌苷酸（IMP）合成的最后两步反应-第九步与第十步,对IMP的合成具有关键的调控作用。克隆连城白鸭、金陵白鸭以及樱桃谷鸭ADSL和PurH基因的完整编码区（CDS）,进行核酸和蛋白序列分析,研究这两个基因在各品种肌肉组织mRNAs表达水平；分别对三个品种鸭肌肉组织这两个基因mRNAs表达水平与肌肉组织肌苷酸（IMP,inosine monophosphate acid）含量进行相关性分析。为揭示我国优良地方鸭种的风味基因结构、研究其生物学功能以及与重要风味物质的关系奠定了理论基础。1 ADSL和PurH基因的克隆测序通过对多个物种ADSL和PurH基因进行同源性比对,寻找高度保守区并在该区域设计先设计一对引物,然后根据已扩片段再设计两对引物扩增两端序列,借助RT-PCR和染色体步移技术获得三个品种鸭ADSL和PurH基因部分cDNA序列,它们包含了完整的编码区,CDS长度分别为1380 bp和1782 bp。2 ADSL和PurH蛋白的生物信息学分析运用生物信息学方法分析三个品种鸭ADSL和PurH基因编码区序列、蛋白结构和进化关系。预测出ADSL和PurH分别编码459和593个氨基酸残基。ADSL理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白,有较为强烈的信号肽和细胞内跨膜结构,蛋白二级结构主要由α螺旋构成,另外含有少量p折叠、p转角及无规则卷曲结构。该蛋白含有腺苷酸基琥珀酸裂解酶蛋白家族的典型结构域PRK08937、且和鸡的蛋白结构域一致。PurH也为一偏碱性蛋白,有不太明显的信号肽,但含有跨膜结构,蛋白二级结构主要由α螺旋与β折叠构成,另外还包含一些卷曲结构和β转角结构。PurH和其它物种该酶一样含有PurH蛋白家族的MGS-like superfamily,AICARFTIMPCHas superfamily典型结构域。同源性分析发现,鸭与鸡的亲缘关系最近,ADSL与其它物种同源性都在75%以上,ATIC与其它物种的同源性也都在79%以上,表明这两个基因在动物的发育进化中是比较保守的。3 Real-time PCR分析ADSL和PurH基因在肌肉组织中的相对表达采用RT-PCR技术,分析了三个品种鸭ADSL和PurH基因在肌肉组织中的相对表达水平,结果表明：ADSL和PurH基因在三个品种鸭的胸肌和腿肌中均表达,连城白鸭、金陵白鸭及樱桃谷鸭之间的表达量差异极显著（P<0.01）；这三个品种中,雌性表达量要极显著高于雄性（P<0.01）。各个体胸肌ADSL基因表达量要显著高于腿肌（P<0.05）,樱桃谷鸭除外（P>0.05）；连城白鸭各个体胸肌PurH基因表达量要显著高于腿肌（P<0.05）,而金陵白鸭和樱桃谷鸭各个体胸肌与腿肌PurH基因表达量差异不显著（P>0.05）。4鸭肌肉组织肌苷酸含量的测定采用高效液相色谱法测定了三个品种鸭胸肌和腿肌中IMP的含量,结果表明：不同品种之间IMP含量差异极显著（P<0.01）,以连城白鸭最高、金陵白鸭次之、樱桃谷鸭最低；同一品种内雌性显著高于雄性（P<0.05）；各个体胸肌显著高于腿肌（P<0.05）。5鸭肌肉组织ADSL和PurH基因mRNA表达量与对应组织肌苷酸含量的相关性分析通过对ADSL和PurH基因mRNA表达量与对应组织IMP含量相关性分析,结果表明：ADSL和PurH基因表达量和对应组织IMP含量有着较高的正相关性。不同品种、不同性别及不同组织（樱桃谷鸭除外）ADSL基因表达量与对应组织肌苷酸含量的相关系数R2分别为0.9592,0.9618,0.9577；不同品种、不同性别PurH基因表达量与对应组织肌苷酸含量的相关系数R2分别为0.9609,0.9584,连城白鸭胸肌和腿肌PurH基因表达量与对应肌苷酸含量的相关系数R2为0.8156,金陵白鸭与樱桃谷鸭各个体胸肌与腿肌PurH基因表达量与对应肌苷酸含量无明显相关性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 肌苷酸及其相关酶的研究概况
• 1 肌苷酸结构与特性
• 1.1 肌苷酸分子结构
• 1.2 肌苷酸特性
• 2 肌苷酸的代谢
• 2.1 肌苷酸的合成
• 2.2 肌苷酸代谢过程中的酶
• 3 肌苷酸代谢相关的酶以及酶的基因研究
• 3.1 谷氨酸胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶（GAPTase）
• 3.2 甘氨酰胺核苷酸合成酶-氨基咪唑核苷酸合成酶-甘氨酰胺核苷酸转甲酰基酶（GARS-AIRS-GART）
• 3.3 甲酰甘氨脒核苷酸合成酶（purL或purLQS）
• 3.4 氨基咪唑核苷酸羧化酶（purE Ⅱ或purK和purEⅠ）
• 3.5 氨基咪唑琥珀基氨甲酰核苷酸（SAICAR）合成酶（purC）
• 3.6 腺苷酸琥珀酸裂解酶（purB或ADSL）
• 3.7 氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶（PurHJ）
• 3.8 腺嘌呤核苷酸脱氨酶（AMPD）
• 4 肌苷酸检测技术
• 5 IMP含量的调控
• 6 肌苷酸研究展望
• 参考文献
• 第二章 基因的克隆及生物信息学分析
• 1 克隆基因的几种常用方法
• 1.1 利用已知探针克隆基因
• 1.2 克隆未知序列的基因
• 1.2.1 随机引物法克隆未知序列基因
• 1.2.2 差异显示PCR（DD-PCR）
• 1.2.3 差减杂交PCR（RDA-PCR）
• 1.3 用特异抗体克隆基因
• 1.4 特异基因的功能克隆
• 1.5 染色体步技术
• 1.6 EST电子克隆及RACE技术的应用
• 1.6.1 EST电子克隆
• 1.6.2 RACE技术的原理
• 1.6.2.1 3’RACE的获得
• 1.6.2.2 5’RACE的获得
• 2 核酸序列分析
• 2.1 ORF（Open Reading Frame）分析
• 2.2 染色体定位
• 2.3 基因结构分析
• 2.4 基因上游调控区分析
• 3 蛋白质结构分析和功能预测
• 3.1 蛋白质氨基酸组成、分子量和等电点分析
• 3.2 疏水性分析
• 3.3 信号肽预测
• 3.4 跨膜区预测
• 3.5 亚细胞定位预测
• 3.6 蛋白质功能结构域分析
• 3.7 蛋白质多序列比对和分子系统发生分析
• 4 小结
• 5 本试验研究目的和意义
• 参考文献
• 第二篇 实验研究
• 第三章 鸭ADSL与PurH基因编码区的克隆测序
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物与样品采集
• 1.1.2 网络资源及软件
• 1.1.3 主要试剂及试剂盒
• 1.1.4 主要仪器
• 1.1.5 主要溶液及其配制
• 1.1.5.1 RNA提取试剂配制
• 1.1.5.2 琼脂糖电泳试剂配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 RT-PCR扩增目的区
• 1.2.2.1 肌肉组织总RNA抽提
• 1.2.2.2 RNA浓度和纯度检测
• 1.2.2.3 RNA完整性检测
• 1.2.2.4 第一链cDNA合成
• 1.2.2.5 PCR扩增ORF区
• 1.2.2.6 琼脂糖电泳检测
• 1.2.2.7 琼脂糖电泳检测
• 1.2.3 cDNA克隆测序
• 1.2.3.1 目的片断回收和纯化
• 1.2.3.2 快速TOP10感受态制备
• 1.2.3.3 连接反应
• 1.2.3.4 转化
• 1.2.3.5 菌落筛选
• 1.2.3.6 菌落PCR鉴定
• 1.2.3.7 质粒抽提
• 1.2.3.8 测序
• 2 结果与分析
• 2.1 鸭ADSL基因CDS区的核酸序列分析
• 2.2 鸭PurH基因CDS区的核酸序列分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 蛋白质序列的生物信息学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 蛋白质氨基酸组成、分子量和等电点分析
• 1.2.2 蛋白质疏水性分析
• 1.2.3 蛋白质信号肽预测
• 1.2.4 跨膜区预测
• 1.2.5 亚细胞定位预测
• 1.2.6 蛋白质功能位点和结构域预测
• 1.2.7 蛋白质氨基酸序列间的多重比对和分子系统发生分析
• 2 结果与分析
• 2.1 ADSL和PurH蛋白质组成、基本理化性质、疏水性和信号肽分析
• 2.2 鸭ADSL和PurH蛋白质功能位点、二级结构以及三级结构预测
• 2.3 同源性比较与系统发育树分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第五章 鸭ADSL和PurH基因mRNA在胸肌和腿肌中的表达分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验动物
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 主要溶液及其配制
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 总RNA抽提
• 1.2.3 RNA浓度和纯度检测
• 1.2.4 第一链cDNA合成
• 1.2.5 cDNA质量检测
• 1.2.6 Real-time PCR
• 1.2.6.1 20 μl反应体系
• 1.2.6.2 反应程序
• 1.2.6.3 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 ADSL基因mRNA表达量分析
• 2.2 PurH基因mRNA表达量分析
• 3 讨论
• 3.1 内参基因的选择
• 3.2 各种RT-PCR方法的比较
• 3.3 ADSL和PurH基因mRNA的相对表达分析
• 4 小结
• 参考文献
• 第六章 鸭肌肉肌苷酸含量的测定与分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要溶液配制
• 1.2.1 PH=7.0的50mmol/l硼酸缓冲溶液配制
• 1.2.2 流动相配制
• 1.2.3 IMP标准溶液配制
• 1.3 仪器与设备
• 1.4 样品制备
• 1.5 色谱分离条件
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第七章 鸭ADSL和PurH基因mRNA表达量与肌苷酸含量的相关性分析
• 1. 材料
• 2. 结果
• 2.1 ADSL基因mRNA表达量与肌肉IMP含量的相关性分析
• 2.2 PurH基因mRNA表达量与肌肉IMP含量的相关性分析
• 3. 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 全文结论
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的学术论文