谷氨酰胺合成酶的表达、纯化、酶学性质及腺苷化现象的研究

论文摘要

L-谷氨酰胺是一种具有高附加值的化合物。酶法作为近年来新兴的方法是对生产L-谷氨酰胺新的探索,具有理论研究和实际生产双重意义。本论文对酶法生产谷氨酰胺的关键酶-谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的谷氨酰胺合成酶（简称GS）进行研究,探索了GS与组氨酸标签（His-tag）融合表达情况;探索了GS在E .coli中增加可溶表达的策略;纯化了GS,研究了其酶学性质;研究了GS的腺苷化以及腺苷化位点定点突变对GS性质的影响。首先考察了GS与组氨酸标签（His-tag）融合对其表达的影响。相比野生GS,N端His-tag对GS可溶表达及酶活影响不大;C端His-tag导致GS完全不可溶表达。生物信息学的分析推测C端His-tag引起GS完全不可溶表达可能是其影响了GS的折叠的动力学过程,而非引起其热力学构象的变化。另外,凝胶过滤色谱表明谷氨酸棒杆菌GS的四级结构存在6聚体和12聚体两种形式。利用T7系统在E. coli中表达野生或N端融合His-tag的GS部分可溶,但大部分以包涵体形式存在。本文随后探索了麦芽糖结合蛋白（MBP）融合、减弱启动子强度和更换宿主细胞对增加GS表达可溶性的影响。结果表明MBP与GS融合表达显著增加了可溶性,但GS酶活完全丧失;Tac启动子使GS可溶组分和包涵体均大幅降低;宿主细胞的改变对GS可溶表达影响不大。利用固定化金属螯合亲和色谱纯化出了N端融合重组His-tag的可溶GS,纯度达90%以上。随后研究了pH、温度、金属离子对GS的影响。发现了GS与底物ATP有相互作用引起OD340吸收,这导致了酶动力学常数无法测量。最后研究了GS腺苷化现象。结果发现,E. coli诱导表达GS过程中外源添加不同浓度的谷氨酰胺对腺苷化程度变化影响不大,均有25%被腺苷化。通过Tyr405Phe定点突变去除了GS腺苷化位点,但野生和突变GS性质对比发现突变引起活性下降已超过了25%腺苷化的影响。同源模型分析表明,Tyr405不仅是腺苷化位点,也位于GS催化中心。定点突变导致活性中心出口的一个柔性环不能有效闭合,引起GS催化活性降低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 谷氨酰胺的性质和生产状况
• 1.1.1 L-谷氨酰胺的基本理化性质
• 1.1.2 谷氨酰胺的市场状况
• 1.2 L-谷氨酰胺的生产方法
• 1.2.1 化学法
• 1.2.2 发酵法
• 1.2.3 酶法
• 1.2.4 基因工程在谷氨酰胺生产中的应用
• 1.3 谷氨酰胺合成酶
• 1.3.1 典型细菌的谷氨酰胺合成酶（GSI）结构
• 1.3.2 细菌 GS 酶催化机理
• 1.3.3 细菌 GS 酶活性调控
• 1.3.4 谷氨酸棒杆菌中的谷氨酰胺合成酶
• 1.4 大肠杆菌表达系统
• 1.4.1 概述
• 1.4.2 大肠杆菌表达载体的构成
• 1.4.3 大肠杆菌表达系统
• 1.5 代谢工程
• 1.6 本论文的意义和目的
• 第2章 GS 酶与6×His 融合表达
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 分子生物学构建过程
• 2.3.2 带有不同位置His-tag 的重组GS 的表达
• 2.3.3 C 端His-tag 导致重组GS 酶完全不可溶表达的机理分析
• 2.3.4 GS 包涵体复性初步研究
• 2.4 本章小结
• 第3章 促进重组GS 酶可溶性表达的探索
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 重组质粒和菌株构建策略及构建过程
• 3.3.2 目标蛋白的表达
• 3.4 本章小结
• 第4章 重组GS 酶的纯化与酶学性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 表达菌株
• 4.2.2 仪器和试剂
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 诱导重组大肠杆菌表达GS 条件的优化
• 4.3.2 带有 His-tag 的重组GS 的纯化
• 4.3.3 重组 GS 酶学性质研究
• 4.4 本章小结
• 第5章 GS 的腺苷化现象研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 表达菌株
• 5.2.2 仪器和试剂
• 5.2.3 培养基
• 5.2.4 实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.4 本章小结
• 第6章 结论和展望
• 6.1 结论
• 6.2 本论文的创新点
• 6.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 仪器与设备
• 附录B 常用生化试剂
• 附录C 培养基和缓冲液配制
• 附录D 聚合酶链式反应（PCR）
• 附录E 酶切与连接
• 附录F 琼脂糖凝胶电泳
• 附录G E. coli 感受态细胞的转化
• 附录H 菌株的培养及表达
• 附录I 考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白浓度
• 附录J 谷氨酰胺合成酶活性测定方法
• 附录K SDS-PAGE 蛋白质电泳
• 附录L E. coli 感受态细胞的制备
• 附录M 凝胶层析（Gel-filtration Chromatography）操作步骤
• 附录N 固定化金属离子螯合亲和层析色谱（IMAC）
• 个人简历和在学期间发表的学术论文