猪胃蛋白酶原A基因克隆、毕赤酵母表达及其酶活性分析

论文摘要

胃蛋白酶广泛存在于脊椎动物胃液中,是一种能在酸性环境下水解多种蛋白质的蛋白水解酶。胃蛋白酶经济价值高,用途广泛,可作为饲料添加剂,用于提高动物饲料利用率,增强仔猪对疾病的抵抗力,降低腹泻发生率,提高仔猪的成活率,降低环境污染；胃蛋白酶在制革、方便食品、奶、口香糖加工制造等行业也有一定的用处。目前,商业、医药途径获得的胃蛋白酶主要从动物胃组织中提取,受动物脏器资源的限制,胃蛋白酶价格较高；容易残留一些动物自身的蛋白酶类,如一些组织蛋白酶等。而微生物反应器具有效率高效,操作简单,能够降低成本等优点,所以,通过筛选微生物反应器,然后规模化生产胃蛋白酶颇有发展前途。本试验的目的是建立一种有效的毕赤酵母真核表达系统,获得能够表达出具有胃蛋白酶活性的菌株。考虑到胃蛋白酶对表达宿主---毕赤酵母的毒害作用,本研究采用胃蛋白酶的前体物胃蛋白酶原A进行表达。通过RT-PCR法从猪胃组织细胞中克隆含胃蛋白酶原A基因编码区的DNA序列,并将该基因片段连接到表达载体pPICZaA中,从而获得重组子pPICZa A-pep A,经PCR和酶切检测后,用限制性内切酶PmeI对重组子pPICZa A-pep A进行线性化处理,经电转化把线性化的重组子pPICZ a A-pep A,整合到表达宿主X-33染色体上,利用含zeocin的YPDS固体培养基平板对转化子进行抗性水平筛选。通过zeocine抗性水平和实时定量RT-PCR法筛选到4个高mRNA表达胃蛋白酶原A基因的毕赤酵母菌株,通过BMGY摇瓶分别培养这4个阳性转化子,菌液离心后,菌体转入BMMY培养液中进行甲醇诱导表达,每隔24h,添加0.5%的甲醇。用Ni SepHarose High Performance亲和层析柱对发酵上清液进行纯化,SDS-PAGE电泳显示,有一条45kDa左右的亮带,该条带位置与预期目的蛋白大小基本一致。这说明在强启动子--醇氧化酶1（AOXl）的作用下,胃蛋白酶原A在毕赤酵母x-33中成功表达。重组胃蛋白酶活性检测显示：重组所获得蛋白酶原,经过酸化处理后,能够表现出胃蛋白酶的降解蛋白质的性质。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中英文缩写词表
• 一、绪论
• 1、引言
• 2、文献综述
• 2.1 概述
• 2.2 胃蛋白酶的研究进展
• 2.2.1 胃蛋白酶及其酶原的结构特征
• 2.2.2 胃蛋白酶原的分类
• 2.2.3 胃蛋白酶的性质和功能
• 2.2.4 胃蛋白酶原A在机体生成机制
• 2.2.5 胃蛋白酶原A的激活过程
• 2.2.6 胃蛋白酶的来源
• 2.2.7 胃蛋白酶基因的克隆和表达
• 2.3 胃蛋白酶的功能和用途
• 2.3.1 胃蛋白酶在饲料工业的应用
• 2.3.2 在皮革工业上的应用
• 2.3.3 在酿酒工业中的应用
• 2.3.4 在医学领域的应用
• 2.4 胃蛋白酶应用中面临的问题
• 2.5 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达体系
• 2.5.1 毕赤酵母宿主的优越性
• 2.5.2 毕赤酵母的菌株种类及表型
• 3、立题依据
• 4、研究目标和内容
• 4.1 研究目的
• 4.2 研究内容
• 5、研究技术路线
• 二、材料与方法
• 1、材料和仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 试剂
• 1.3 主要培养基
• 1.4 主要溶液
• 1.5 主要仪器设备
• 1.6 引物设计与合成
• 2、实验方法
• 2.1 胃蛋白酶原A基因的克隆
• 2.1.1 胃组织总RNA的提取
• 2.1.2 基因的扩增
• 2.1.3 TA克隆和测序
• 2.2 P.pastoris/pPICZαA-pepsinogen A表达载体的构建
• 2.2.1 含EcoRⅠ和XbaⅠ限制性酶切位点目的基因片段扩增
• 2.2.2 PCR产物和pPICZαA质粒的酶切与连接
• 2.2.3 大肠杆菌Top 10感受态细胞的制备、转化与阳性转化子的筛选
• 2.3 重组猪胃蛋白酶原A的毕赤酵母x-33转化与表达
• 2.3.1 重组表达载体pPICZαA-pep A的线性化
• 2.3.2 pPICZαA-pep A重组质粒毕赤酵母的转化与转化子的筛选
• 2.3.3 重组酵母基因组PCR检测
• 2.3.4 重组猪胃蛋白酶原A的诱导表达
• 2.3.5 重组蛋白的纯化
• 2.3.6 重组蛋白的SDS-PAGE检测
• 2.4 重组胃蛋白酶蛋白活性检测
• 三、实验结果与分析
• 1、猪胃蛋白酶原A基因TA克隆
• 1.1 总RNA的提取与pepsinogen A编码区RT-PCR扩增
• 1.2 Pepsinogen A基因TA克隆
• 2、pPICZαA-pep A重组表达质粒的构建及鉴定
• 2.1 含酶切位点pepsinogen A基因片段的扩增结果
• 2.2 pPICZαA质粒的双酶切
• 2.3 阳性克隆PCR检测与酶切鉴定
• 3、P.pastoris/pPICZαA-pep A表达菌株的转化与筛选
• 3.1 重组质粒的线性化
• 3.2 PCR检测转化子
• 3.3 定量实时PCR（q RT-PCR）对转化子RNA表达量的检测
• 4、猪胃蛋白酶原A在P.pastoris中的表达、纯化
• 5、重组胃蛋白酶原A的酸化处理
• 6、重组胃蛋白酶蛋白活性检测
• 四、讨论
• 1、高mRNA表达胃蛋白酶原A酵母菌株的筛选
• 2、毕赤酵母表达系统及pPICZαA表达载体
• 2.1 毕赤酵母表达系统
• 2.2 pPICZαA表达载体选择
• 3、胃蛋白酶原A在毕赤酵母中的表达
• 5、重组胃蛋白酶的活性检测
• 五、结论与展望
• 1、胃蛋白酶原A提高表达产量的研究
• 2、胃蛋白酶原A的激活和活性检测
• 3、改造pep A的分子结构提高其活性和稳定性
• 4、pep A在动物生产中的应用
• 参考文献
• 致谢
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 附录四