渗透胁迫下白花柽柳SSH文库构建及质膜水孔蛋白基因克隆

论文摘要

地球上约三分之一土地属于干旱区或半干旱区,在这些地方,缺水已成为制约农林业发展的瓶颈,严重影响人类的生存和发展。深入研究生长在干旱地区的植物的抗旱机理,克隆与抗旱相关的基因,对于大幅度提高干旱地区的生产潜力有重要的战略意义。本研究正是以此为目的,将新疆白花柽柳用终浓度25%（WN）的聚乙二醇6000进行胁迫处理,取其小枝为试材,利用抑制性消减技术（SSH）构建cDNA文库,分析在渗透胁迫下,基因表达情况。根据文库信息,用RACE技术克隆与抗旱相关的全长基因,探讨白花柽柳的抗渗透胁迫分子机理,为抗旱分子育种工作奠定理论和物质基础。 随机挑取SSH文库的288个阳性克隆进行测序,共获得207条有效的序列,已登录GenBank,登录号为EB187088-EBl87295。对98个Unique EST序列进行BlastX分析,有79个EST与已知功能的基因序列相似,19个与未知功能的基因相似。对该文库进行GO分类,使我们从不同角度理解98个Unique序列在细胞组件、分子功能和生物学途径中的作用。根据这些EST所代表的基因的生理生化作用,按功能将其分为10类。其中有52个基因与渗透胁迫关系密切,对它们进行了分析讨论。柽柳的抗渗透胁迫过程涉及信号转导与基因的表达调控、渗透胁迫物质的合成、防御反应、转运作用与离子平衡、活性氧清除、救援、防御蛋白合成、修复和保护光合系统等多种途径的综合作用。 获得与抗渗透胁迫密切相关的G蛋白类（EB187186、EB187233、EB187126）、钙网蛋白（EB187218）、丝氨酸/苏氨酸激酶（EB187235）、钙结合EF家族蛋白（EB187165）、钙依赖蛋白激酶（EB187146）、腺苷酸环化酶关联蛋白（EB187203）、MAP3Ka（EB187182）、海藻糖-6-磷酸合酶（EB187156）、脱水素DHN6（EB187153）、α-甘露糖苷酶（EB187148）、脂质转运蛋白（EB187132）、质膜水通道蛋白（EB187092）、过氧化氢酶（EB187294）、eIF1（EB187220）、翻译起始因子相似蛋白（EB187205）、SKP1蛋白（EB187159）、苹果酸脱氢酶（EB187089）、类亮氨酸拉链蛋白（EB187102）、类锌指蛋白（EB187252）等重要基因的遗传信息。 利用RACE技术从渗透胁迫处理的白花柽柳的小枝中克隆一个全长质膜水孔蛋白基因,该基因包含1043bp核苷酸序列,其中70bp前导序列,864bp的开放阅读框及109bp的3′非编码区,编码287个氨基酸,分子量约30.9KD,命名为TaAQP,GenBank登录号DQ660891。 TaAQP具有MIP基因家族序列的信号序列HINPAVTFG,并且含有高等植物质膜水孔蛋白的特征序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/VN;经预测具有6个跨膜区,其氨基酸残基与MIP蛋白保守区序列100%一致,预测该蛋

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 1 绪论
• 1.1 柽柳属植物水分特性研究进展
• 1.2 柽柳属植物抗旱生理指标的研究
• 1.3 植物水分胁迫的分子生物学研究进展
• 1.3.1 植物水分胁迫响应中所表达的基因
• 1.3.2 植物水分胁迫响应中基因表达的调节
• 1.3.3 怪柳属植物抗逆性分子机理的研究
• 1.4 生物信息学与表达序列标签
• 1.4.1 生物信息学
• 1.4.2 表达序列标签
• 1.5 研究基因表达差异的方法比较
• 1.5.1 SSH技术
• 1.5.2 SSH技术的优缺点
• 1.6 cDNA末端快速扩增技术（RACE）
• 1.7 植物水孔蛋白的研究概况
• 1.8 本课题的研究目的和意义
• 2 渗透胁迫下白花柽柳抑制性消减文库构建
• 2.1 材料、试剂和设备
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 酶及化学试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 消减杂交的引物序列
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 SDS法提取白花柽柳总RNA
• 2.2.2 白花柽柳mRNA的分离
• 2.2.3 白花柽柳SSH文库的构建
• 2.2.4 测序模板制备
• 2.2.5 EST数据处理
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 提取总RNA和分离mRNA质量检测
• 2.3.2 反转录及酶切效果检测
• 2.3.3 SSH文库消减效率检测
• 2.3.4 SSH文库的质量分析
• 2.3.5 序列结果分析
• 2.3.6 讨论
• 2.4 本章小结
• 3 质膜水孔蛋白基因克隆
• 3.1 材料和试剂
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 引物合成
• 3.2.2 总 RNA提取
• 3.2.3 第一链cDNA合成
• 3.2.4 5′RACE反应
• 3.2.5 电泳检测
• 3.2.6 胶回收、T-载体连接，细菌转化
• 3.2.7 PCR检测连接效果
• 3.2.8 测序
• 3.2.9 拼接、比较、全长基因克隆及分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 总RNA的DNA酶消化检测
• 3.3.2 测序、拼接及TaAQP克隆
• 3.3.3 白花柽柳TaAQP基因序列
• 3.3.4 白花柽柳TaAQP基因的氨基酸序列特征
• 3.3.5 TaAQP其它结构域预测
• 3.3.6 蛋白疏水性预测
• 3.3.7 跨膜区预测
• 3.3.8 15种植物MIP蛋白的同源性分析
• 3.3.9 氨基酸序列三级结构预测
• 3.3.10 信号肽预测
• 3.3.11 讨论
• 3.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 独创性声明
• 学位论文版权使用授权书