ALV-J和REV的分离及蛋鸡群白血病J亚群病毒的序列分析和致病性试验

论文摘要

禽白血病和网状内皮组织增生症都是能引起禽类肿瘤和免疫抑制的疾病。J亚群禽白血病病毒（Subgroup J of avian leukosis virus,ALV-J）是上世纪80年代末Payne L N等首先从肉用型鸡中分离鉴定出来的禽白血病病毒新的亚群,所致肿瘤多为骨髓样细胞瘤。网状内皮组织增生症病毒（Reticuloenendotheliosis virus,REV）感染自然宿主后,大多情况下也不会对机体细胞造成损害,但某些情况下会导致细胞转化（瘤细胞化）或引起细胞病变。本论文研究调查了3个蛋鸡群的ALV-J的感染情况,对发生肿瘤的病鸡做了病理切片分析,其病理变化类似于ALV-J在感染肉用型鸡的变化。通过接种鸡胚成纤维细胞（CEF）及特异性单抗的间接荧光抗体反应（IFA）,从中国商品代蛋鸡群成功的分离到2株J亚群白血病病（ALV-J）。对其致病性做了初步的研究探讨,同时对其env基因编码的氨基酸序列及3′LTR序列与国内外来源于白羽肉鸡的毒株作了比较分析。结果显示,这两株病毒的gp85基因编码的氨基酸序列与国外5株毒株同源性为83.4-87.3%,与国内来源于白羽肉鸡的8毒株病毒同源性为86.4-89.6%。gp37基因编码的氨基酸序列与国外毒株同源性为91.8-96.4%,与国内毒株同源性为93.4-95.9%,gp85和gp37都发生了较大的变异。另外,所有8个肉鸡来源的中国分离株都与美国株4817在其3′Ter片断的“E”区内有一个几乎完全相同的127bp的缺失性突变。为此我们推测中国的ALV-J的流行毒株都来自一个更近的共同原始病毒株。但是从蛋鸡分离到的SD07LK1和SD07LK2这两个毒株与国内过去已报道的毒株有很大的差异,没有这个缺失性突变。另外,相对于1989年分离的原型毒,在已比较的毒株中这两个毒株3′Ter部分的缺失性突变最小。甚至比美国90年代分离的毒株还小。很显然,蛋用型鸡ALV-J与从白羽肉用型鸡分离的中国毒株有着不同的来源。但究竟是通过常规的横向传染在我国鸡场中从白羽肉鸡传入蛋用型鸡,还是引进的祖代鸡中已存在ALV-J,还有待进一步阐明。但是如果是后一种情况,这意味着我国应对每年引进的蛋用型祖代鸡实施ALV-J检疫。本研究不仅在国内首次从蛋用型鸡分离到ALV-J,更进一步证明它与从白羽肉用型鸡分离的中国毒株有着不同的来源。另外,我们对蛋鸡来源的ALV-J的致病性做了初步的研究。检测REV和ALV-J的众多方法中,病毒的分离鉴定仍然是检测ALV-J和REV最为有效和可靠的方法。在2006-2007年间,通过细胞培养和间接免疫荧光试验的（IFA）方法分离到多株ALV-J和REV。同时我们通过这些方法从出现腺胃炎的蛋鸡群中分离到了REV。这些试验工作,一方面,准确的检测了病毒的感染情况,为疾病的诊断提供了很好的参考。另一方面,为研究这种病毒的致病性和其他致病机理提供了活病毒素材,这是一个需要持续不断的工作,对于鸡群流行病毒株的分离和实时检测对于控制疾病,预测疾病流行具有重要意义。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 1 ALV-J 和 REV 的基本概况
• 2 ALV-J 和REV 的分子病毒学特性
• 2.1 ALV-J 的分子病毒学特性
• 2.2 REV 的分子病毒学特性
• 3 ALV-J 和REV 的致病性
• 3.1 ALV-J 的致病性
• 3.2 REV 的致病性
• 4 ALV-J 和 REV 的免疫抑制作用
• 4.1 ALV-J 的免疫抑制作用
• 4.2 REV 的免疫抑制作用
• 5 ALV-J 和REV 的传播方式
• 5.1 ALV-J 的传播方式
• 5.2 REV 的传播方式
• 6 ALV-J 和REV 的鉴别与诊断
• 6.1 ALV-J 的鉴别与诊断
• 6.2 REV 的诊断和鉴别
• 7 ALV-J 和REV 囊膜糖蛋白基因的变异
• 8 ALV-J 和REV 的预防和控制
• 9 本研究的目的及意义
• 研究内容
• 试验一中国蛋鸡群ALV-J 的分离鉴定及分子进化分析
• 1 材料与方法
• 1.1 病料的来源
• 1.2 单克隆抗体
• 1.3 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠和兔抗鸡二抗
• 1.4 克隆载体和宿主菌
• 1.5 分子生物学试剂
• 1.6 病料的病理切片HE 染色检查和石蜡切片的免疫酶
• 1.6.1 病理切片的制作方法
• 1.6.2 病理切片HE 染色过程
• 1.6.3 石蜡切片的免疫酶染色程序
• 1.6.4 石蜡切片的免疫酶结果判定
• 1.7 病毒的实验室分离
• 1.7.1 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备
• 1.7.2 病毒分离
• 1.8 病毒的间接免疫荧光试验（IFA）鉴定
• 1.9 病毒的PCR 鉴定
• 1.10 env 基因的扩增、克隆与测序
• 1.10.1 病毒模板的制备
• 1.10.2 env 基因的扩增
• 1.10.3 env 基因PCR 产物DNA 电泳
• 1.10.4 PCR 产物的回收与定量
• 1.10.5 DNA 的连接反应
• 1.10.6 TG1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.10.7 连接产物的转化
• 1.10.8 质粒DNA 的提取
• 1.10.9 重组质粒DNA 的酶切鉴定
• 1.10.10 阳性克隆序列测定
• 1.11 分离株gp85 和gp37 的氨基酸序列及3′Ter 核苷酸序列的比较
• 1.12 ALV-J SD07LK1 株和NX0101 株对海兰灰蛋鸡的致病性试验
• 1.12.1 病毒
• 1.12.2 实验动物
• 1.12.3 免疫动物用疫苗
• 1.12.4 Reed-Muench 氏法测定病毒的TCID50 方法
• 1.12.5 1 日龄商品代海兰灰蛋鸡的人工感染
• 1.12.6 ND、AIV 灭活疫苗的免疫及HI 抗体滴度的测定
• 2 结果
• 2.1 病理切片检测结果
• 2.2 免疫酶染色结果
• 2.3 IFA 检测结果
• 2.4 env 基因PCR 扩增结果
• 2.5 env 基因重组质粒的双酶切鉴定结果
• 2.6 SD07LK1 和SD07LK2 株gp85 基因编码的氨基酸同源性比较
• 2.7 SD07LK1 和SD07LK2 株gp37 基因编码的氨基酸同源性比较
• 2.8 SD07LK1 和SD07LK2 株与其他毒株的3′Ter 序列比较
• 2.9 SD07LK1 株和NX0101 株对海兰灰蛋鸡致病性试验结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 试验二 间接免疫荧光方法检测肿瘤疑似病料中的ALV-J 和REV
• 1 材料与方法
• 1.1 病料来源
• 1.2 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备
• 1.3 单克隆抗体
• 1.4 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠二抗
• 1.5 病毒分离与复制
• 1.5.1 血液中分离ALV-J 或REV
• 1.5.2 病料组织中分离ALV-J 或REV
• 1.6 间接免疫荧光试验（IFA）
• 2 结果
• 2.1 用ALV-J 特异性单克隆抗体IFA 检测结果
• 2.2 用REV 特异性单克隆抗体IFA 检测结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 实验三 从蛋鸡群患有腺胃炎的病鸡中分离出REV
• 1 材料与方法
• 1.1 病料来源
• 1.2 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备
• 1.3 单克隆抗体
• 1.4 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠二抗
• 1.5 引物
• 1.6 病毒分离鉴定
• 1.6.1 病毒分离与复制
• 1.6.2 间接免疫荧光试验（IFA）
• 1.6.3 细胞DNA 的提取
• 1.6.4 REV 病毒 env 基因 402bp 片段条带扩增
• 1.6.5 PCR 产物DNA 电泳
• 2 结果
• 2.1 PCR 扩增结果
• 2.2 用REV 特异性单克隆抗体IFA 检测结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士研究生期间的论文情况
• 个人简历