高效降解畜禽血红蛋白菌株选育与降解特性研究

论文题目: 高效降解畜禽血红蛋白菌株选育与降解特性研究

论文类型: 硕士论文

论文专业: 食品科学

作者: 张滨

导师: 马美湖

关键词: 蜡状芽孢杆菌亚种,血红蛋白,分离筛选,诱变,发酵

文献来源: 湖南农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 我国是畜禽血液生产大国，每年生产血液达1.9×109kg，含蛋白质3.6×108kg。由于原料血液极难保存，鲜血极易被污染；血腥味浓；消化性和适口性及色泽感官极差等因素严重制约了畜禽血液的综合利用，致使大量宝贵的畜禽血资源浪费，并造成环境污染。畜禽血液微生物降解，由于投入低，能耗省，蛋白质、肽和氨基酸含量高，而被公认为血液综合利用的一个方向。从取样的土壤中分离筛选出16株菌株，并分别对其进行蛋白质水解圈比值、蛋白酶活力，以及在Hb发酵过程中，游离氨基酸含量、可溶性蛋白质含量、Hb降解率等指标测定，最终确定一株菌株（编号为：Lact5.Ⅲ）作为研究对象。经过菌落、菌株形态观察以及生理生化测试，并根据细菌分类检索表查得编号为Lact5.Ⅲ及其诱变菌株为蜡状芽孢杆菌亚种（B. cereus）。通过将蜡状芽孢杆菌亚种（B. cereus）在Hb发酵培养液中连续驯化诱导培养以及进行NA、UV等定向诱变处理，以进一步提高其产蛋白酶量和降解Hb的能力。在Hb发酵培养液中进行驯化诱导，该菌株产蛋白酶活力从原来的483.81U／ml提高至631.22U／ml；对该菌株进行定向诱变，产蛋白酶活力由483.81U／ml增强至第五代诱变菌株的1254.36U／ml，可溶性蛋白质含量、游离氨基酸含量及Hb降解率分别从2.69％、1.44mg／100ml、40.25％增加至3.52％、24.6mg／100ml、53.29％。对Hb降解机理进行研究，结果发现：蜡状芽孢杆菌亚种（B. cereus）在动物血红蛋白（Hb）培养液中，测定产蛋白酶特性，该菌株适宜在偏酸性（pH 6.5），发酵温度在30～40℃之间的环境中生长；Ca2+及司班20对其蛋白酶的合成有促进作用。从SDS-PAGE凝胶电泳图分析发现：原始菌株（No1）处于标准样（M）水平线齐平的色带要比诱变菌株（No2）宽，而且诱变菌株（No2）的电泳图比原始菌株（No1）多一条明显的色带。从氨基酸含量测定结果分析得出：诱变菌株中的游离氨基酸总含量比原始菌株的提高5.75％；苯丙氨酸、组氨酸、蛋氨酸等提高了90％以上。而苏氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸与未发酵血液中同类氨基酸相比分别下降了-360％、-1.08％、-340％和-485.71％；与其原始菌株相比，除苏氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸五种氨基酸含量略有下降之外，其它13种氨基酸及氨基酸总量均有提高。在发酵血液的应用方面，在新鲜血液中添加一定比例的玉米粉、麸皮等混合物为发酵原料，利用多菌株（蜡状芽孢杆菌诱变菌株、米曲霉、啤酒酵母、乳酸菌），采用多菌种二次发酵法发酵而成的微生态多菌株发酵血液产品，其氨基酸含量高为100mg／100g，可溶性蛋白质含量达20％以上，产品为浅红色，醇香浓郁，具有发酵血液特殊的芳香，无异味。

论文目录:

摘要

Abstract

第一章 文献综述

1 动物血液中血红蛋白(Hb)

1.1 畜禽血液成分

1.2 血红蛋白分子结构特点

2 己有菌种利用情况

2.1 从自然界或现有的菌种中选择

2.2 经诱导、诱变等生物技术处理后获得

3 发酵方式

3.1 按发酵菌种数分类

3.1.1 单菌种发酵

3.1.2 多菌种发酵

3.2 按发酵次数分类

3.2.1 一次性发酵法

3.2.2 二次发酵法

3.3 按发酵方式分类

3.3.1 固态发酵法

3.3.2 液态发酵法

3.3.3 固定化菌株连续发酵法

4 发酵关键控制点

4.1 pH值

4.2 温度

4.3 氧气

4.4 发酵时间

5 微生物蛋白酶降解血红蛋白(Hb)机理

6 畜禽血液发酵产品的应用

6.1 用于动物饲料

6.2 用于食品加工业

6.3 用于生物制药

第二章 Hb降解菌株分离筛选

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样采集

1.1.2 主要原料

1.1.3 主要药品与试剂

1.1.4 培养基

1.1.5 主要仪器设备

1.2 方法

1.2.1 分离方法

1.2.1.1 富集培养

1.2.1.2 分离培养

1.2.1.3 划线分离培养

1.2.2 菌株分离筛选设计方法

1.2.3 测定方法

1.2.3.1 菌落计数方法

1.2.3.2 水浸法

1.2.3.3 简单染色法

1.2.3.4 革兰氏染色方法

1.2.3.5 蛋白质水解圈比值的测定

1.2.3.6 蛋白酶活力测定

1.2.3.7 氨基酸含量的测定

1.2.3.8 可溶性蛋白质含量的测定

1.2.3.9 Hb降解率的测定

2. 结果与分析

2.1 分离培养基的选择

2.2 分离菌株菌落形态特征

2.3 分离菌株的初步确定

2.4 菌落、菌体形态结构观察

2.5 分离菌株降解Hb能力的测定及Hb降解菌株的确定

3 小结

第三章 提高被选菌株降解Hb能力的研究

第一节 被选菌株驯化诱导及定向诱变

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 被选菌株

1.1.2 主要原料

1.1.3 主要药品与试剂

1.1.4 培养基

1.1.5 主要仪器设备

1.2 方法

1.2.1 被选菌株驯化诱导

1.2.2 被选菌株驯化诱导设计流程图

1.2.3 亚硝酸诱变剂的制备

1.2.4 亚硝酸诱变

1.2.5 紫外灯预热

1.2.6 紫外线诱变

1.2.7 避光培养

1.2.8 诱变菌株的筛选与确定

1.2.9 被选菌株定向诱变设计方法

1.2.10 测定方法

1.2.10.1 蛋白酶活力测定

1.2.10.2 氨基酸含量的测定

1.2.10.3 可溶性蛋白质含量的测定

1.2.10.4 Hb降解率的测定

2 结果与分析

2.1 连续驯化诱导被选菌株对Hb降解效果的测定

2.2 连续驯化诱导被选菌株对在Hb培养液中产蛋白酶活力的影响

2.3 定向诱导被选菌株对Hb降解效果的测定

2.4 定向诱导被选菌株对在Hb培养液中产蛋白酶活力的影响

3 小结

第二节 被选诱菌株的微生物学特性鉴定

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 被选菌株

1.1.2 主要原料

1.1.3 主要药品与试剂

1.1.4 培养基

1.1.5 主要仪器设备

1.2 测定方法

1.2.1 革兰氏染色方法

1.2.2 菌落形态特征观察

1.2.3 菌体结构形态特征观察

1.2.4 菌株的鉴定

1.2.5 菌株毒力鉴定

2 结果与分析

2.1 被选诱变菌株菌落特征、菌体形态结构变化

2.2 被选菌株生理生化测试

2.3 被选诱菌株毒力鉴定结果

3 小结

第四章 被选诱菌株降解Hb条件的研究

第一节 被选诱菌株产蛋白酶特性研究

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 被选诱菌株

1.1.2 主要原料

1.1.3 主要药品与试剂

1.1.4 培养基

1.1.5 主要仪器设备

1.2 方法

1.2.1 红血蛋白(Hb)提取方案

1.2.2 蛋白酶活力测定方法

1.2.3 发酵温度对被选诱菌株产蛋白酶特性的影响

1.2.4 发酵时间对被选诱菌株产蛋白酶特性的影响

1.2.5 初始pH对被选诱菌株产蛋白酶特性的影响

1.2.6 金属离子对被选诱菌株产蛋白酶特性的影响

1.2.7 表面活性剂对被选诱菌株产蛋白酶特性的影响

2 结果与分析

2.1 发酵温度对被选诱菌株产蛋白酶特性的影响

2.2 发酵时间对被选诱菌株产蛋白酶特性的影响

2.3 初始pH对被选诱菌株产蛋白酶特性的影响

2.4 金属离子对被选诱菌株产蛋白酶特性的影响

2.5 表面活性剂对被选诱菌株产蛋白酶特性的影响

3. 小结

第二节 被选诱菌株降解Hb效果的研究

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 被选诱菌株

1.1.2 主要原料

1.1.3 主要药品与试剂

1.1.4 培养基

1.1.5 主要仪器设备

1.2 方法

1.2.1 血红蛋白(Hb)提取方案

1.2.2 蛋白酶活力测定方法

1.2.3 氨基酸含量的测定

1.3.4 可溶性蛋白质含量的测定

1.2.5 Hb降解为低分子量蛋白质的比较测定

1.2.6 Hb降解产物游离氨基酸的测定方法

2 结果与分析

2.1 被选诱菌株降解Hb效果的比较测定

2.2 Hb降解为低分子量蛋白质的比较测定

2.3 Hb降解为氨基酸的种类及含量的比较测定

3. 小结

第五章 被选诱菌株发酵猪血液应用研究

1. 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

1.1.2 主要原料

1.1.3 主要药品与试剂

1.1.4 培养基

1.1.5 主要仪器设备

1.2 方法

1.2.1 被选诱菌株发酵猪血工艺设计

1.2.2 原料混合比例的确定

1.2.3 发酵温度的确定

1.2.4 发酵时间的确定

1.2.5 发酵方式的确定

1.2.5.1 单菌株一次发酵法

1.2.5.2 单菌株二次发酵法

1.2.5.3 多菌株一次发酵法

1.2.5.4 多菌株二次发酵法

1.2.6 正交试验设计方法

1.2.7 测定方法

1.2.7.1 菌落计数方法

1.2.7.2 蛋白酶活力的测定

1.2.7.3 氨基酸含量的测定

1.2.7.4 可溶性蛋白质含量的测定

1.2.7.5 Hb降解率的测定

1.2.7.6 产品色、香、味评价

2 结果与分析

2.1 原料混合比例对被选诱菌株猪血发酵的影响

2.2 发酵温度对被选诱菌株猪血发酵的影响

2.3 发酵时间对被选诱菌株猪血发酵的影响

2.4 单菌株发酵对被选诱菌株猪血发酵的影响

2.5 多菌株发酵对被选诱菌株猪血发酵的影响

2.6 被选诱菌株多因素正交试验对猪血液发酵效果的影响

2.6.1 显著性分析

2.6.2 优化方案的确定

2.7 发酵工艺及工艺参数

2.7.1 新鲜猪血液的采集

2.7.2 拌料

2.7.3 发酵

2.7.4 烘干

2.8 多菌株选择的依据

2.9 血液发酵产品质量指标

3. 小结

总结

本文创新之处

存在问题与展望

参考文献

致谢

个人简介

附录

发布时间: 2007-12-06

参考文献

• [1].人工血液制品的开发利用——对人血红蛋白的提纯、改造制备研究[D]. 樊晶.天津医科大学2002
• [2].超滤膜分离在猪血红蛋白纯化工艺中的应用研究[D]. 刘峰.重庆大学2010
• [3].猪血红蛋白及其戊二醛聚合猪血红蛋白的分离纯化工艺研究[D]. 周勃.西北大学2008
• [4].戊二醛聚合猪血红蛋白制备血红蛋白氧载体的初步研究[D]. 吴宝平.西北大学2006
• [5].人工诱变选育肌苷高产菌株[D]. 纪龙翔.河南师范大学2013
• [6].腺苷高产菌株选育及发酵条件的优化[D]. 李金鑫.河南师范大学2015
• [7].右旋糖酐交联血红蛋白的制备及功能评价[D]. 张珊.燕山大学2016
• [8].Zymomonas mobilis ZM4乙醇发酵副产物产生相关基因敲除菌株的构建和评价[D]. 王翠.天津大学2013
• [9].产生物表面活性剂菌株的筛选、鉴定及其产物的初步研究[D]. 白艳芬.曲阜师范大学2012
• [10].阿维菌素高产菌株的选育[D]. 王洪滨.河北大学2004

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• [4].猪血发酵菌株的诱变、鉴定与综合降解技术的研究[D]. 万佳蓉.湖南农业大学2007
• [5].猪血酶解脱色技术的研究[D]. 于美娟.湖南农业大学2005
• [6].利用猪血制取亚硝基血红蛋白和亚硝基血红素多肽的研究[D]. 黄群.湖南农业大学2005
• [7].猪血蛋白酶法脱色工艺优化研究[D]. 车志敏.西北农林科技大学2007
• [8].酶解猪血蛋白中生物活性肽的纯化和功能研究[D]. 江波.吉林大学2006
• [9].畜禽血粉膨化加工工艺研究[D]. 马稚昱.东北农业大学2003
• [10].酶解猪血红蛋白制备小肽方法的研究[D]. 杨万根.湖南农业大学2004

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