木贼抗氧化损伤作用的有效部位提取及对人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用

论文摘要

目的:提取、分离并测定木贼（Equisetum）中抗氧化损伤作用的有效部位。观察其对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）致人脐静脉内皮细胞（HUVEC）损伤后细胞增殖与凋亡的影响,以进一步确认木贼保护血管内皮、抗动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）早期损伤的有效部位及机制。方法:第一部分1.木贼有效部位的提取和分离称取适量木贼饮片加12倍量的70%乙醇,电热套加热回流提取3次,每次2h,过滤得提取液。分批将提取液减压浓缩,经大孔树脂分别以蒸馏水、30%乙醇及70%乙醇洗脱分离。收集70%乙醇洗脱液作为有效部位测试样品。2.木贼有效部位含量的测定将槲皮素和阿魏酸标准品稀释成不同倍数浓度,用紫外分光光度计测定其吸光度,绘制标准曲线并得回归方程。用同样方法检测提取样品的吸光度,根据回归方程得出其中有效部位（总黄酮和总酚酸）含量。精量一定体积的提取样品,将其烘干达恒重,用所测有效部位含量与之相比,以计算所含有效部位纯度。3干预细胞药物溶液的配置将一定量浓缩液用用二甲基亚砜（DMSO）充分溶解后加入无血清培养基DMEM配成所需浓度（500μg/ml）药物溶液,灭菌、-20℃保存备用。第二部分1.低密度脂蛋白的分离、氧化和鉴定采用化学沉淀法提取低密度脂蛋白（LDL）。将LDL置于10μmol/L浓度CuSO4溶液中37℃氧化24h,经PH7.4 PBS透析24h,过滤除菌,得ox-LDL,4℃保存。琼脂糖凝胶电泳鉴定,紫外分光法监测氧化过程及氧化程度,考马斯亮蓝法测定浓度。2.人脐静脉内皮细胞的培养与分组人脐静脉内皮细胞株复苏后于含15%新生小牛血清的DMEM中培养,胰酶法消化传代。取对数生长期细胞,随机分成对照组、氧化损伤组、木贼提取物干预组。将细胞培养液换成无血清DMEM,培养6h后对照组与损伤组分别加入无血清DMEM,木贼提取物干预组加入等量木贼有效部位药物溶液（终浓度为50μg/ml）。继续培养1h后木贼提取物干预组与损伤组分别加入ox-LDL（终浓度为80μg/ml）,对照组加入无血清DMEM。共培养12小时后收集细胞和培养液用于检测。3.指标检测分别于倒置显微镜及扫描电镜下观察各组细胞的形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞周期及Caspase-3蛋白表达量,半定量RT-PCR检测内皮细胞Caspase-3 mRNA、Bax mRNA和Bcl-2 mRNA的表达。结果:第一部分1.木贼中总黄酮和总酚酸的含量:以槲皮素计单位质量木贼中总黄酮含量为1.69mg/g,以阿魏酸计单位质量木贼中总酚酸含量为1.23mg/g;单位质量木贼中总黄酮与总酚酸合计平均含量为2.92mg/g。2.木贼有效部位的纯度:为63.28%。第二部分1.形态学观察倒置显微镜下对照组细胞生长状态良好,贴壁牢固,细胞间连接紧密,呈单层铺路石样镶嵌排列;损伤组细胞形态改变明显,细胞收缩、变圆,胞体变小,连接疏松,较多细胞脱落;木贼提取物干预组细胞生长状态明显好于损伤组,数量较多,呈单层铺路石样镶嵌排列,似对照组。扫描电镜下对照组细胞外形饱满、胞质丰富,细胞间连接紧密;损伤组细胞表面有泡状突起及凹陷空洞形成多呈凋亡状态;木贼提取物干预组组细胞形态明显好转,外形饱满,胞质丰富。2.流式细胞仪检测内皮细胞周期的改变与对照组比较,损伤组停留在G0/G1期细胞明显增多（P<0.01）,S和G2/M期细胞减少;与损伤组相比,木贼提取物干预组G0/G1期细胞百分数则显著降低（P<0.01）,S和G2/M期比例均升高。损伤组内皮细胞增值指数PI较对照组显著降低（P<0.01）,木贼提取物干预组PI较损伤组则明显升高（P<0.01）。3.流式细胞仪检测内皮细胞凋亡率的改变损伤组内皮细胞调亡率与对照组相比明显升高（P<0.01）,而木贼提取物干预组调亡率则比损伤组明显降低（P<0.01）。4.木贼有效部位对内皮细胞Caspase-3蛋白及Caspase-3 mRNA表达的影响Caspase-3蛋白及Caspase-3mRNA在损伤组的表达均明显高于对照组（P<0.01）;而两者在木贼提取物干预组则比损伤组明显降低（P<0.01）。5.木贼有效部位对内皮细胞Bax mRNA和Bcl-2 mRNA表达的影响损伤组内皮细胞Bax mRNA的表达明显高于对照组（P<0.01）;与损伤组相比,木贼提取物干预组Bax mRNA的表达明显降低（P<0.01）。Bcl-2 mRNA的表达与上述趋势相反。Bax/Bcl-2比值各组间差异更为明显,损伤组远高于对照组（P<0.01）,木贼提取物干预组则显著降低（P<0.01）。结论:通过此工艺流程,得到了较高纯度的总黄酮和总酚酸,达到作为有效部位的标准。通过其干预细胞实验证实木贼提取物可通过多途径抑制ox-LDL对内皮细胞的损伤,从多环节发挥抗早期AS作用,推测提取物中黄酮类及酚酸类化合物即为有效部位的药理活性成分。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 木贼抗氧化损伤作用的有效部位提取
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 小结
• 第二部分 木贼有效部位对氧化低密度脂蛋白致人脐静脉内皮细胞凋亡的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 疏风散热类药物对AS 早期影响作用及相关成分与药理活性
• 致谢
• 个人简历