复苏的骨髓间充质干细胞的体外培养和多向分化潜能的研究

论文摘要

骨髓中除含有能分化发育成各种血细胞的造血干细胞之外,还含有可产生非造血组织的间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）。MSCs一方面支持骨髓中造血干细胞的生存、生长和分化。 另一方面, 经许多体外实验证明,它们是一种具有多向分化潜能的细胞,具有极强的自我复制能力,在特定的条件下可以分化为中胚层起源的多种组织和细胞（如:成骨细胞、软骨细胞、肌细胞等）,甚至可以分化为跨胚层的细胞（如神经细胞）。MSCs具有取材方便,不存在免疫排斥反应,而且易于进行细胞扩增,易于临床应用的特点,是一种重要的组织工程种子细胞。由于MSCs具有独特的细胞增殖分裂模式,使外源基因易于导入和表达,从而使其有望成为一种在人类医学上潜在的细胞治疗和基因治疗的靶细胞,在多种造血以外组织的缺陷性疾病、退行性疾病和遗传性疾病的细胞治疗和基因治疗中具有重要的应用前景。 但是MSCs在体外长期培养后也会遇到一些不利因素,诸如基因漂流,细胞衰老,分化,表型不稳定性,污染或者是培养箱故障等,而这些均会影响对MSCs的应用。因此,适时地冻存MSCs是将来储备细胞种子的一种重要手段。然而,冻存后MSCs的扩增和分化能力如何,值得进一步研究。 本实验对成人的骨髓间充质干细胞（human mesenchyma].stem cells,hMSCs）进行了体外分离、培养和初步的细胞诱导分化,并对其生长方式进行观察,旨在建立一种分离、培养hMSCs并诱导其向软骨细胞、脂肪细胞和神经细胞转化的有效方法,为hMSCs作为组织工程的细胞来源提供实验依据。同时为检测冻存的hMSCs在复苏并传至15代后是否仍具有向软骨、脂肪和神经元多向分化的潜能,我们在通过黏附方法从骨髓中获得hMSCs并进行冻存的基础上,复苏细胞并传至第15代,然后在相应的条件培养液作用下依次诱导成软骨细胞,脂肪细胞和神经元细胞,观察其形态学变化以及在对应的诱导液的作用下胶原Ⅱ、三油酸甘油酯、巢蛋白（Nestin）和神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）的表达,从而研究冻存细胞的扩增和分化潜能。研究结果表明,冻存的hMSCs在复苏后仍是具有单一特征的、均质的细胞群。其

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 1.MSCs的生物学特征
• 2.MSCs的分离、扩增
• 3.MSCs的多向分化潜能
• 4.MSCs的冻存
• 5.MSCs在医学上的应用前景
• 6 结论和展望
• 参考文献（REPERENCES）
• 前言
• 材料和方法
• 1.实验材料
• 1.1 骨髓标本来源
• 1.2 试剂
• 1.3 实验仪器
• 1.4 实验试剂的配制
• 2.实验方法
• 2.1 hMSCs的分离和原代培养
• 2.2 hMSCs的体外扩增
• 2.3 hMSCs的冻存和复苏
• 2.4 复苏后hMSCs的流式细胞仪分析
• 2.5 复苏细胞生长曲线的测定
• 2.6 成软骨细胞的诱导和检测
• 2.7 脂肪细胞的诱导和检测
• 2.8 神经细胞的诱导和检测
• 结果
• 1.hMSCs的分离、培养及形态特征
• 2.复苏后的hMSCs的体外扩增及指标测定
• 3.向软骨细胞方向的诱导
• 4.向脂肪细胞方向的诱导
• 5.向神经元细胞方向的诱导
• 讨论
• 1.hMSCs的体外分离、培养和扩增
• 2.复苏细胞的生长曲线的测定
• 3.诱导分化
• 结论
• 参考文献
• 致谢