蜡梅CpSAMT基因遗传转化及功能分析的研究

论文摘要

蜡梅（Chimonanthus praecox L.）为我国特有传统名花,冬季开放,芳香宜人,具有很高的观赏价值,同时也是提取香精的理想材料。水杨酸羧基位甲基转移酶（SAMT）是合成芳香物质水杨酸甲酯的关键酶,本实验室已经从蜡梅花瓣中克隆出该酶的全长序列。研究其遗传转化方法及表达调控机理对阐明基因功能,探索香气成分代谢途径以及花香植物遗传改良等具有极大的意义。本研究利用农杆菌介导将CpSAMT基因转入烟草和矮牵牛中,对转化植株的花香成分进行顶空固相微萃取和气相色谱质谱相结合方法进行分析。主要结果如下：1.成功克隆回收CpSAMT基因片段,构建PBI121-CpSAMT植物双元表达载体,利用冻融法导入农杆菌EHA105中。2.农杆菌介导将CpSAMT基因转入烟草和矮牵牛,经抗性培养基筛选培养,获得转基因烟草70株,矮牵牛40株。3.采用PCR方法对转基因烟草和矮牵牛检测,结果显示转基因烟草16株中有15株扩增出了目的条带；转基因矮牵牛9株均能扩增出目的条带。进一步的RT-PCR检测结果表明,阳性植株均发生了正确转录。4.对转基因前后烟草鲜花采用顶空固相微萃取以及气相色谱—质谱技术（HS-SPME-GC-MS）分析花香成分变化。转CpSAMT基因烟草中有高含量的苯甲醇、苯甲醛、己烯醇和石竹烯等成分。转PBI121载体烟草中雪松醇、芳樟醇成分含量较高。未转基因烟草中有较高含量的苯甲酸甲酯,而在转基因植株中未能检测出其成分。5.对转基因前后矮牵牛花香成分分析表明,转CpSAMT基因矮牵牛苯甲醛和苯乙醇明显升高,并产生较高含量的香茅醇、乙酸香茅酯和乙酸苯乙酯等成分。转PBI121载体矮牵牛苯甲酸甲酯含量增加,并产生苯甲醇和乙酸苄酯。邻苯二甲酸二异丁酯在未转化矮牵牛中含量最高。水杨酸甲酯没有发生实质性变化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 蜡梅研究进展
• 1.1.1.1 蜡梅功能基因研究进展
• 1.1.1.2 蜡梅花香成分研究进展
• 1.1.2 SAMT基因研究进展
• 1.1.3 苯丙酸类化合物/苯环型化合物代谢途径
• 1.2 研究的目的、意义及内容
• 1.3 研究技术路线
• 2 蜡梅SAMT基因转化烟草的研究
• 2.1 材料、试剂与仪器
• 2.1.1 植物材料、菌株和质粒
• 2.1.2 试剂和仪器
• 2.1.2.1 试剂和药品
• 2.1.2.2 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 蜡梅SAMT基因植物双元表达载体的构建及转化农杆菌
• 2.2.1.1 目的基因全长片段的获取
• 2.2.1.2 转化大肠杆菌及测序
• 2.2.1.3 表达载体构建
• 2.2.1.4 表达载体质粒转化农杆菌
• 2.2.2 农杆菌介导转化烟草
• 2.2.2.1 烟草主要培养基
• 2.2.2.2 技术路线
• 2.2.2.3 农杆菌介导转化烟草
• 2.2.3 转基因烟草植株的鉴定
• 2.2.3.1 转化植株的PCR检测
• 2.2.3.2 转基因植株的RT-PCR检测
• 2.2.4 转化前后烟草鲜花挥发性成分比较分析
• 2.2.4.1 植物材料及进样
• 2.2.4.2 GC-MS分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 双元表达载体的构建
• 2.3.1.1 目的基因全长片段的获取、转化大肠杆菌及测序
• 2.3.1.2 表达载体构建
• 2.3.1.3 转化农杆菌
• 2.3.2 农杆菌介导转化烟草
• 2.3.3 转基因烟草植株的鉴定
• 2.3.3.1 转化植株的PCR检测
• 2.3.3.2 转基因植株的RT-PCR检测
• 2.3.4 转化前后烟草鲜花挥发性成分比较分析
• 3 蜡梅SAMT基因转化矮牵牛的研究
• 3.1 材料、试剂和仪器
• 3.1.1 植物材料、菌株、质粒
• 3.1.2 试剂和仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 农杆菌介导转化矮牵牛
• 3.2.2 转基因矮牵牛植株的鉴定
• 3.2.2.1 转化植株的PCR检测
• 3.2.2.2 转基因植株的RT-PCR检测
• 3.2.3 转化前后矮牵牛花香成分比较分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 农杆菌介导转化矮牵牛
• 3.3.2 转基因矮牵牛植株的鉴定
• 3.3.2.1 转化植株的PCR检测
• 3.3.2.2 转基因植株的RT-PCR检测
• 3.3.3 转化前后矮牵牛花香成分比较分析
• 4 讨论与展望
• 4.1 植物双元表达载体的构建
• 4.2 农杆菌介导转化烟草和矮牵牛
• 4.3 转基因植株的分子检测
• 4.4 转基因植株中的花香成分分析
• 4.5 展望
• 参考文献
• 致谢