百脉根离子通道蛋白POLLUX及其与翻译延伸因子EF1A相互作用的研究

论文摘要

根瘤菌与豆科植物相互作用早期信号转导成为近年来共生体系研究的热点问题。共生信号转导研究中,苜蓿和百脉根两种模式植物部分关键信号转导基因相继克隆。对这些关键基因功能和作用机制研究,揭示其相互调控因素,有利于阐明共生信号转导的分子机制。酵母双杂交技术为搜寻信号转导基因调控因子提供了一条有利途径。离子通道蛋白POLLUX是共生信号途径上游的关键功能基因,其突变后,百脉根除不能结瘤外,生理上失去了钙离子振荡表型。本实验以以百脉根POLLUX膜内区段（C-Pollux）为模板,设计引物构建了诱饵质粒pGBKT7-C-Pollux。以pGBKT7-C-Pollux为诱饵,筛选百脉根酵母双杂交文库,获得翻译延伸因子EF1A等多个与POLLUX膜内区段相互作用的克隆子。酵母回转实验、测序及NCBI-BLAST分析,表明翻译延伸因子EF1A与离子通道蛋白POLLUX膜内区段（C-POLLUX）相互作用。依据百脉根数据库BLAST分析得到的序列,设计cDNA引物,RT-PCR扩增得到翻译延伸因子EF1A全长cDNA。表达翻译延伸因子EF1A及其两个截短区段ED219、ED267和离子通道蛋白C-POLLUX,并利用相应琼脂糖凝胶珠分离纯化目的蛋白。通过Pull-down和Western Blotting实验证明离子通道蛋白C-POLLUC与翻译延伸因子EF1A存在相互作用。利用小样rnating方法,检验其他关键共生信号转导基因与翻译延伸因子在酵母体内相互作用,表明结瘤因子受体NFR1,共生受体激酶SYMRK和离子通道蛋白CASTOR与EF1A在酵母体内存在相互作用,而结瘤因子受体NFR5、钙和钙调素结合蛋白CCaMK与翻译延伸因子EF1A在酵母体内不能够相互作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 共生固氮的研究背景与意义
• 1.1.1 根瘤菌生理特性、分类
• 1.1.2 豆科植物根瘤形成的过程
• 1.1.3 共生信号转导在根瘤菌中的分子机制
• 1.1.4 豆科植物中早期共生信号转导的分子机制
• 1.1.5 钙离子信号
• 1.2 离子通道蛋白
• 1.2.1 离子通道的分类和功能
• 1.2.2 钙离子通道
• 1.3 翻译延伸因子EF1A
• 1.3.1 翻译延伸因子1A（EF1A）基因的结构和功能
• 1.4 酵母双杂交系统简介
• 1.5 研究的意义和目的
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 营养液和培养基配方
• 2.1.4 缓冲液和反应试剂
• 2.1.5 蛋白质纯化试剂
• 2.1.6 Western Blotting试剂
• 2.1.7 主要分子生物学试剂
• 2.1.8 植物材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 RNA的抽提
• 2.2.2 RT-PCR合成cDNA第一链
• 2.2.3 诱饵质粒的构建
• 2.2.4 酵母感受态细胞的制备
• 2.2.5 菌落PCR
• 2.2.6 酵母双杂交筛选
• 2.2.6.1 检测DNA-BD融合蛋白的转录活性
• 2.2.6.2 诱饵菌株的毒性测试
• 2.2.6.3 诱饵菌株和文库菌株杂交
• 2.2.6.4 酵母质粒的抽提
• 2.2.7 POLLUX-RCK-pGADT7重组子的构建
• 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞（电转）的制备以及转化
• 2.2.9 大肠杆菌质粒的抽提
• 2.2.10 蛋白质表达纯化
• 2.2.11 β-半乳糖苷酶活性检测
• 2.2.12 Western Blotting验证相互作用
• 3 结果与分析
• 3.1 百脉根Pollux-RCK cDNA片段的克隆及序列分析
• 3.2 Pollux-RCK酵母双杂交诱饵质粒的构建
• 3.3 百脉根cDNA文库的筛选
• 3.4 阳性克隆的PCR及酶切鉴定
• 3.5 阳性克隆DNA序列分析及功能预测
• 3.6 酵母双杂验证POLLUX-RCK与EF1A蛋白相互作用
• 3.7 EF1A与共生信号转导基因相互作用
• 3.8 Pollux-C融合蛋白及EF1A融合蛋白的表达和纯化
• 3.9 体外Pollux-RCK与EF1A蛋白相互作用的鉴定
• 4 总结与讨论
• 参考文献
• 致谢