硫酸长春新碱聚合物超声微泡造影剂研究

论文摘要

超声造影是近年随着超声造影剂制备技术和图像显影技术的不断完善逐步发展起来的新技术。超声破坏携带药物或基因的微泡造影剂定位释放技术,是一种新型的无创性基因嫁接与药物释放技术。其作用机制主要为空化效应（Cavitation）和“声孔作用”（Sonoporation）。超声微泡造影剂（Ultrasound Microbubble Constrast Agent, UMCA）通常是指直径为2μm至几十微米的有壳微气泡,微泡壳厚1至500 nm,壳体材料多为白蛋白,磷脂,半乳糖,聚合物等,泡内气体通常是CO2,氟碳气（C3F8,C4F10）,N2以及空气等。长春新碱（Vincristine, VCR）是提取自夹竹桃科植物长春花的一种生物碱,临床上广泛用于治疗神经细胞瘤、脑瘤、肺癌等实体瘤,属细胞毒类抗肿瘤药物,其作用机制为结合微管蛋白,抑制微管蛋白的聚合,影响微管的装配及纺锤丝的形成。该课题UMCA采用聚乙二醇（PEG）修饰,微泡表面被柔顺而亲水的PEG链部分覆盖,极性PEG增强UMCA的亲水性,减少血浆蛋白与UMCA膜的相互作用,降低被巨噬细胞吞噬的可能,延长在循环系统的滞留时间,可有效提高靶向效率。该课题以PLGA/（PLGA-PEG）为包合材料,NH4HCO3为致孔剂,采用复乳-溶剂挥发技术制备硫酸长春新碱乳酸-乙醇酸共聚物-聚乙二醇超声微泡造影剂（ Vincristine-loaded PLGA-PEG Ultrasound Microbubbles Contrast Agent, VCR-PLGA-PEG-UMCA）,利用UMCA作为药物载体,借助体外超声空化的能量在预定肿瘤区域击破微泡,从而使药物在局部组织释放和渗透,提高局部药物浓度,达到靶向治疗的目的。第一部分处方前研究1.建立VCR的UV含量测定方法,其标准曲线方程为A = 0.0121C-0.0025,r = 0.9998,在4.00 20.00μg·mL-1范围内浓度与吸收度线性良好,精密度、回收率、稳定性均符合方法学要求。2.采用摇瓶法测定VCR在不同CH2Cl2/PBS（pH 3.0,pH 4.0,pH 5.0,pH 6.0）和CH2Cl2/H2O体系中的表观油/水分配系数（P）,其值分别为0.855,1.887,2.174,2.224,2.264,表明VCR亲脂性随pH值增高而增加。为了提高包封率,使VCR尽量分布在水相,制备UMCA时可以选择CH2Cl2/PBS（pH 4.0）的油水体系。第二部分VCR-PLGA-PEG-UMCA制备1.以微泡的粒径和形态为指标,考察超声时间,乳化剂类型,乳化剂浓度,内水相体积和NH4HCO3浓度对微泡形态的影响;以EE为指标,单因素试验初选制备条件,分别为投药量,不同有机溶剂,油水相体积比,PLGA/（PLGA-PEG）比例,PLGA/（PLGA-PEG）浓度,Span80浓度,内、外水相pH,外水相NaCl浓度,CH2Cl2挥干方法对VCR-PLGA-PEG-UMCA包封率的影响。2.单因素试验考察筛选出对VCR-PLGA-PEG-UMCA制备工艺影响较大因素:投药量,内水相与油相体积比,PLGA/（PLGA-PEG）浓度, PLGA/（PLGA-PEG）比例。采用正交试验设计优化VCR-PLGA-PEG-UMCA处方,以包封率（S）为指标进行评分,优选出最佳工艺条件:投药量为2.0 mg,油相与水相体积比为2:0.1,PLGA/（PLGA-PEG）的浓度为0.5%,PLGA/（PLGA-PEG）的比例为2:1。3.最佳处方制备的VCR-PLGA-PEG-UMCA外观形态为球形或类球形,表面光滑,无明显黏连,粒径分布均匀,平均粒径为1.27μm,粒径范围为500～1400 nm,包封率为（37.63±0.61）%,载药量（1.25±0.23）%,Zeta电位为-24.88 mV,分散性良好。4.初步稳定性考察载药微泡冻干粉在4℃下60 d内稳定性良好;生理盐水复溶VCR-PLGA-PEG-UMCA一周后观察,颜色变浅,呈白色,底部有沉积。一月后,溶液分层,上层颜色为浅白色,下层多数沉淀。第三部分VCR-PLGA-PEG-UMCA体外释药性质研究1.建立VCR体外释放UV分析测定方法,其标准曲线方程为A = 0.0157 C-0.0007,r = 0.9997,在2.00～20.00μg·mL-1浓度与吸光度线性良好,精密度、回收率、稳定性均符合方法学要求。2.比较以分子量2万和4万PLGA为膜材制备微泡的体外药物释放行为,实验表明:以分子量2万PLGA制备微泡体外药物释放较快,约20天基本释放完毕,而分子量4万PLGA制备微泡体外药物约30天基本释放完毕。3. PEG对VCR-PLGA-PEG-UMCA体外释药行为有一定影响。添加PEG能加快微泡的药物释放,可能原因是PEG具有亲水性,增加PLGA的降解速率从而提高溶出,故释药速率加快。4.考察超声照射和未加超声照射下微泡的体外药物释放行为,实验结果表明:未超声照射组微泡释药符合缓释制剂的释放特点,超声照射组60 min内释放药物达80%以上。第四部分VCR-PLGA-PEG-UMCA体内外超声显影成像初步研究1.采用超声诊断仪观察微泡具有良好的增加超声信号的能力,体外成像清晰。2.使用超声诊断仪观察微泡在超声照射作用下具有增强兔体内心腔超声显影效果,为进一步超声定位靶向给药提供直接可靠的依据。第五部分VCR-PLGA-PEG-UMCA兔体内药动学初步研究1、建立兔血浆中VCR的HPLC含量测定方法,在0.105 20.010μg·mL-1浓度范围内线性良好,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,其回归方程为:A = 264.43 C– 58.237,r = 0.9996。该方法准确可靠,专属性强,重现性好,符合血药浓度分析的要求。2、以VCR注射液为参比,对VCR-PLGA-PEG-UMCA在兔体内的药动学进行研究,采用DAS软件进药代动力学行数据分析。结果表明:VCR-PLGA-PEG-UMCA和VCR注射液均符合双隔室模型（权重系数为1/C2）,两种制剂药时曲线相似。从AUC0-24h来看,VCR-PLGA-PEG-UMC的生物利用度有所提高。该课题以PLGA-PEG为包膜材料、NH4HCO3为致孔材料,采用复乳-溶剂挥干技术制备VCR-PLGA-PEG-UMCA。其体外释药受聚合物材料溶蚀速率控制,具有良好的缓释效果。该课题以微泡的粒径、形态和包封率为指标,探讨不同因素对制备UMCA条件的影响,建立UV测定包封率和体外药物释放的方法。获得的VCR-PLGA-PEG-UMCA体内外显影效果好,其兔体内药动学参数AUC增加,生物利用度好,为进一步超声破坏微泡的靶向释药提供一定的基础。该课题的设计、试验及制剂的体内外评价目前尚未见相关文献报道。

论文目录

• 符号说明
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 处方前研究
• 第一节 VCR 含量测定方法
• 1 材料与仪器
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二节 VCR 表观油/水分配系数研究
• 1 材料与仪器
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二部分 VCR-PLGA-PEG-UMCA 制备和性质
• 第一节 单因素考察制备VCR-PLGA-PEG-UMCA
• 1 材料与仪器
• 2 方法和结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二节 VCR-PLGA-PEG-UMCA 处方设计与优化
• 1 材料与仪器
• 2 方法和结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三部分 VCR-PLGA-PEG-UMCA 体外释药性质研究
• 第一节 体外分析方法的建立
• 1 材料与仪器
• 2 方法与结果
• 3 小结
• 第二节 不同分子量聚合物体外释药行为比较
• 1 材料与仪器
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三节 PEG 对VCR-PLGA-PEG-UMCA 体外释药行为影响
• 1 材料与仪器
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四节 体外施加超声对VCR-PLGA-PEG-UMCA 释药行为影响
• 1 材料与仪器
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四部分 VCR-PLGA-PEG-UMCA 体内外超声显影成像初步研究
• 第一节 VCR-PLGA-PEG-UMCA 体外超声显影成像研究
• 1 材料与仪器
• 2 方法与结果
• 3 小结
• 第二节 VCR-PLGA-PEG-UMCA 体内超声显影成像研究
• 1 材料与仪器
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五部分 VCR-PLGA-PEG-UMCA 兔体内药代动力学研究
• 1 材料与仪器
• 2 方法与结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表文章及科研情况