抑制淀粉分支酶类基因表达对稻米品质影响的研究

论文摘要

淀粉是农业中最重要的加工原料。通过酶处理,淀粉可被加工成各种甜料,并且可以被用来作为发酵的原料,同时,可作为干淀粉用于各种不同用途。天然的或化学修饰过的淀粉广泛用于食品和非食品工业,而特定的理化特性是决定淀粉特殊用途的最主要因素。淀粉是由直链淀粉与支链淀粉两种成分组成,为了有效利用这两种成分的各自特性,培育出仅含有直链淀粉或支链淀粉的植物将是很有必要的。目前,科学家们已经利用基因工程等技术,对控制支链淀粉合成的分支酶基因进行遗传操作,在玉米和马铃薯等作物中培育出了直链淀粉高达70%以上的新品种,然而在水稻中还没有相关报导。本研究利用根癌农杆菌介导的转基因技术将Sbe1和/或Sbe3的反义或RNA干扰结构分别导入具有不同直链淀粉含量的水稻受体品种中,有效地调控了分支酶基因的表达,进而研究抑制分支酶类基因表达对稻米品质的影响,为利用基因工程技术改良稻米提供依据和材料。主要研究结果如下:1、利用已获得的武香9915和广陵香糯来源的转反义Sbe1/Sbe3,Sbe1-RNAi和Sbe3-RNAi基因材料,对其自交后代进行分子检测,从其自交后代中分别选育到了纯合系材料。2、对转基因纯合系成熟种子胚乳分支酶表达的Western杂交分析表明,转反义Sbe1/Sbe3纯合系成熟种子中SBE1和SBE3的表达量均明显低于未转化对照;转Sbe1-RNAi纯合系成熟种子中SBE1的表达量明显下降,SBE3的表达量也略低于未转化对照;转Sbe3 -RNAi纯合系成熟种子中SBE3的表达量明显下降,而SBE1的表达量较未转化对照有所增加。同时,我们还比较了不同转基因系中成熟种子胚乳中GBSS的表达量,结果显示,转反义Sbe1/Sbe3纯合系成熟种子中GBSS的表达量较未转化对照略有提高。3、对选育到的纯合系材料种子中的表观直链淀粉含量进行测定,结果显示,转反义Sbe1/Sbe3和Sbe3-RNAi种子表观直链淀粉含量较未转化对照都有明显的提高,其中武香9915来源的转反义Sbe1/Sbe3基因的纯合系中,直链淀粉含量最高达到26.96%,比未转化对照提高了70.22%。广陵香糯来源的转Sbe3-RNAi基因的纯合系中,直链淀粉含量最高达到19.73%,比未转化对照提高了12.5倍。而对于转Sbe1-RNAi基因的纯合系植株,直链淀粉含量较未转化对照略有下降。4、转基因水稻种子中内源分支酶表达受抑制和表观直链淀粉含量改变后,各类转基因纯合系种子的其它淀粉品质性状也有明显的变化。统计分析结果表明随着表观直链淀粉含量的提高,胶稠度有变硬的趋势,某些转基因纯合系的糊化温度下降,但与直链淀粉含量的相关性不高,淀粉粘滞性谱（RVA）特性也有一些变化,且淀粉粘滞性各特征值同直链淀粉含量有不同程度的相关性。5、当转基因水稻种子中内源分支酶表达受抑制后,淀粉粒的形状、大小和结构有较明显的变化。转反义Sbe1/Sbe3和Sbe3-RNAi基因纯合系糙米的外观和粒重出现很大变化,表现为籽粒皱缩、垩白增多、粒重变小。转基因稻米中表观直链淀粉含量、粒重与籽粒厚度间呈一定的相关性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 1 前言
• 1.1 淀粉粒及淀粉的结构
• 1.2 淀粉生物合成的酶学特性
• 1.3 植物中淀粉分支酶的功能研究
• 1.3.1 SBE 的同工型及其编码基因
• 1.3.2 SBE 编码基因表达的特点
• 1.4 反义RNA 和RNA 干扰技术
• 1.4.1 反义技术及其在植物基因工程中的应用
• 1.4.2 RNA 干扰技术
• 1.5 本研究的主要目的
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 PCR 引物
• 2.1.3 化学试剂
• 2.2 水稻总DNA 的PCR 分析
• 2.3 水稻分支酶表达的WESTERN 杂交分析
• 2.3.1 水稻成熟种子总蛋白的提取
• 2.3.2 SDS-PAGE
• 2.3.3 Western 杂交分析
• 2.4 水稻成熟种子中GBSS 表达量分析
• 2.4.1 水稻成熟种子GBSS 蛋白的提取
• 2.4.2 SDS-PAGE
• 2.5 稻米理化品质性状的测定
• 2.5.1 样品前处理
• 2.5.2 直链淀粉含量的测定
• 2.5.3 胶稠度的测定
• 2.5.4 糊化温度的测定
• 2.6 稻米淀粉粘滞性谱的测定
• 2.7 稻米籽粒扫描电镜观察
• 2.8 稻米籽粒外观与形态检测
• 3 结果与分析
• 3.1 转基因水稻自交后代的PCR 分析及纯合系的选育
• 3.2 转基因水稻成熟种子中内源SBE1 和SBE3 的表达
• 3.3 转基因水稻成熟种子中内源蜡质基因的表达
• 3.4 抑制SBE 表达对稻米表观直链淀粉含量的影响
• 3.4.1 非糯稻中抑制SBE 表达对稻米AAC 的影响
• 3.4.2 糯稻中抑制SBE 表达对稻米AAC 的影响
• 3.5 抑制SBE 表达对稻米胶稠度与糊化温度的影响
• 3.5.1 非糯稻中抑制SBE 表达对稻米胶稠度与糊化温度的影响
• 3.5.2 糯稻中抑制SBE 表达对稻米胶稠度与糊化温度的影响
• 3.6 抑制SBE 表达对稻米淀粉RVA 谱的影响
• 3.6.1 非糯稻中抑制SBE 表达对稻米RVA 谱的影响
• 3.6.2 糯稻中抑制SBE 表达对稻米RVA 谱的影响
• 3.7 抑制SBE 表达对稻米淀粉粒结构的影响
• 4 小结与讨论
• 4.1 研究小结
• 4.2 抑制不同分支酶基因表达后提高AAC 效果的比较
• 4.3 导入反义SBE1/SBE3,SBE1 干扰结构和 SBE3 干扰结构对改变不同类型水稻（粳稻或糯稻）淀粉组成的影响
• 4.4 转基因水稻中表观直链淀粉含量与其它品质特性间的关系
• 参考文献
• 致谢