以sbe A和B为靶标的RNAi载体构建及对马铃薯的转化

以sbe A和B为靶标的RNAi载体构建及对马铃薯的转化

论文摘要

马铃薯(Solanum tuberosum L.)淀粉是一种重要的食品和工业原料。尤其是马铃薯直链淀粉,因其特殊的理化性质而被广泛应用。然而,目前生产上推广的马铃薯栽培品种的直链淀粉含量仅为总淀粉含量的17%,因此,培育高直链淀粉品种对于扩大马铃薯的应用范围和提高其经济价值将具有重要的意义。马铃薯高直链淀粉材料的培育主要是通过品种间杂交和促进芽变来筛选突变体,但由于马铃薯栽培种为同源四倍体,其染色体杂合性较高和基因分离复杂,选择较为困难,同时受倍性差异的限制,栽培种无法与一些具有高直链淀粉的野生种质(75%左右为二倍体)进行有性杂交,限制了野生种质在作物改良上的应用。本研究采用RNA干扰技术(RNA interfence,RNAi),以淀粉分支酶(Starch Branching Enzyme,SBE)基因sbe A和sbe B为靶标进行同时干扰,以期待选育出马铃薯高直链淀粉的新品系,在生产上有其积极的生态意义和经济意义。实验结果如下:1.克隆到淀粉分支酶(SBE)基因: sbe A和sbe B,的部分片段。测序结果表明,克隆的sbe A序列大小为415bp,该序列与GenBank中已公布的序列的同源性为99%。克隆的sbe B序列大小为302bp,该序列与GenBank中已公布的序列的同源性为99%。之后的亚克隆成功得到sbe A和sbe B的融合基因,并引入了适当的酶切位点。2.克隆到烟草drepp 1基因内含子片段。测序结果表明,克隆的片段大小为300bp,该序列与GeneBank中公布的序列同源性达94%。这段非编码序列为ihpRNA的间隔区,在植物体内转录时形成发卡结构,从而大大提高了沉默效率。3.构建了以CaMV 35S组成型启动子驱动的含有‘正向sbe融合片段-drepp 1内含子-反向sbe融合片段’的植物表达载体pPSZIF,并将该载体导入根癌农杆菌LBA4404。4.在遗传转化过程中,先对受体再生体系建立进行了研究。选用‘陇薯3号’、‘Favorita’和‘Shapody’的茎段、试管薯薄片作为外植体材料,以MS为培养基基本成分,对生长激素的浓度和配比进行了优化组合,筛选出有利于受体材料高效再生的培养基配方。最终确定了有利于茎段愈伤诱导的培养基为: MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA(陇薯3号’、‘Favorita’);MS+2.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA (‘Shapody’)本实验还进行了农杆菌介导马铃薯淀粉分支酶RNAi片段转化马铃薯的研究,初步建立了三个不同品种的马铃薯茎段的再生体系并优化了遗传转化体系。5.通过外植体Kan敏感性试验,确定了马铃薯茎段、薯片筛选的Kan使用浓度,茎段为50mg/L、薯片为25 mg/L为宜。通过预培养时间、共培养时间对转化的影响研究,建立和优化了转化体系。茎段的预培养2天,共培养时间茎段为2天、薯片以1天为宜。

论文目录

  • 摘要
  • SUMMARY
  • Ⅰ 引 言
  • Ⅱ 文献综述
  • 2.1 马铃薯淀粉特点及应用
  • 2.1.1 马铃薯天然淀粉的独特优点
  • 2.1.2 马铃薯淀粉的用途
  • 2.1.3 马铃薯直链淀粉的应用前景
  • 2.2 马铃薯淀粉的合成
  • 2.2.1 马铃薯淀粉的结构
  • 2.2.2 马铃薯淀粉生物合成
  • 2.3 马铃薯淀粉的遗传改良
  • 2.3.1 提高马铃薯淀粉含量
  • 2.3.2 提高支链淀粉的含量
  • 2.3.3 提高直链淀粉的含量
  • 2.4 RNA 干涉(RNAI)
  • 2.4.1 转录后基因沉默现象的发现及定义
  • 2.4.2 转录后基因沉默的作用机制
  • 2.4.3 siRNA 制备方法
  • 2.4.4 RNAi 诱导技术的发展
  • 2.4.5 RNAi 技术的应用
  • 2.4.6 RNAi 技术的优点
  • 2.4.7 RNAi 技术中存在的问题
  • 2.5 本研究的目的和意义
  • 2.6 实验技术路线
  • Ⅲ 实验材料及方法
  • 3.1 材料
  • 3.1.1 植物材料
  • 3.1.2 菌种和质粒
  • 3.1.3 工具酶和试剂
  • 3.1.4 培养基
  • 3.2 方法
  • 3.2.1 质粒DNA 的制备
  • 3.2.2 根癌农杆菌质粒的制备
  • 3.2.3 基因克隆
  • 3.2.4 根癌农杆菌介导法对马铃薯的遗传转化
  • Ⅳ 结果与分析
  • 4.1 sbe CDNA 部分片段及intron 部分片段的克隆
  • 4.1.1 烟草drepp1 基因内含子片段的克隆
  • 4.1.2 sbe cDNA 部分片段的克隆
  • 4.2 sbe 片段的融合
  • 4.3 表达载体的构建
  • 4.4 植物表达载体 PPSZIF 转化根癌农杆菌
  • 4.5 根癌农杆菌介导法对马铃薯的遗传转化研究
  • 4.5.1 马铃薯再生体系的建立
  • 4.5.2 农杆菌介导的转化体系优化
  • ⅴ 讨论
  • 5.1 关于hpRNA 靶基因反向重复片段的长度选择
  • 5.2 关于RNAi 载体构建策略
  • 5.3 关于农杆菌介导的马铃薯转化
  • 5.3.1 不同品种马铃薯的遗传转化再生体系的建立
  • 5.3.2 关于遗传转化体系的优化
  • Ⅵ 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附图
  • 个人简介
  • 导师简介
  • 相关论文文献

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