论文摘要
目的：构建pAAV-EGFP及pAAV-BDNF重组腺相关病毒,测定其感染滴度。观察AAV-BDNF对链脲佐菌素（STZ）造模大鼠视网膜神经节细胞数量影响,通过检测大鼠存活的荧光金（Fluorogold,FG）染料逆标的RGCs进行数量统计以及检测视觉诱发电位及视网膜电图来评价表达BDNF的重组AAV载体介导的基因治疗的神经保护效果。方法：1.pAAV-EGFP构建：从pCAGGS中克隆CBA promoter,并与pSEWB同时用Apa和EcoRI进行酶切消化,随后进行胶回收纯化以及连接转化,获得pCBA-EGFP-WPRE。使用限制性内切酶酶切和PCR方法检测构建质粒的准确性。使用磷酸钙转染方法检测质粒的基因表达活性。2. pAAV-BDNF构建：从大鼠脑中抽提总RNA,使用RT-PCR方法克隆融合有H i s-tag的大鼠BDNF基因,并将pCBA-EGFP-WPRE同时用HindIII和EcoRI进行酶切消化,随后胶回收纯化及连接转化,进而获得pCBA-BDNF-WPRE。使用限制性内切酶酶切和PCR方法检测构建质粒的准确性。使用磷酸钙转染方法检测质粒的基因表达活性。Western-blotting分析视网膜中转染病毒获取的蛋白含量。3.建立糖尿病大鼠模型,玻璃体腔注射EGFP或BDNF/His-tag融合蛋白的重组AAV病毒载体,不同时间点观察存活的荧光金（Fluorogold,FG）染料逆标的RGCs数量,并进行视网膜电图及视觉诱发电位检测。4. BDNF受体TrkB阻断实验检测未被转染AAV-BDNF而存活的RGC数量,并进行视网膜电图及视觉诱发电位检测。结果：1.成功构建了pAAV-EGFP-WPRE及pAAV-BDNF-WPRE重组质粒。包装制备了腺相关病毒（rAAV-EGFP及rAAV-BDNF）,经纯化、浓缩后病毒滴度为3.0×109／ml。rAAV-EGFP主射大鼠玻璃体腔3周后,视网膜冰冻切片,荧光显微镜下可观察到荧光表达,Western-blotting分析显示视网膜组织高表达EGFP及BDNF蛋白。2.应用表达BDNF的重组AAV病毒载体进行基因治疗3个月、6个月、9个月之后,分别进行了总视网膜、中心视网膜、周边视网膜RGC存活数量的统计。治疗组和对照组FG逆标的RGC数量都明显少于正常视网膜（P<0.05）,但在各时间点,AAV-BDNF台疗组存活的RGC数量都明显多于AAV-EGFP对照组（P<0.05）,同时AAV-BDNF治疗组存活的RGC数量在6个月后就不再发生明显减少（P>0.05）：基因治疗3个月后发现,AAV-BDNF治疗组中被重组AAV病毒载体转染的表达BDNF的RGC数量明显多于AAV-EGFP对照组中表达EGFP的细胞数量,说明了良好的治疗效果。同时,治疗组中没有被转染的EGC数量也明显多于对照组。BDNF受体TrkB阻断实验表明,AAV-BDNF治疗组中未被转染的神经节细胞的数量发生明显下降,说明了活的细胞可能是通过吸收周围被转染的细胞所分泌的BDNF而获得保护。3.视觉诱发电位检测分析,AAV-BDNF台疗组和AAV-EGFP对照组P波振幅值明显小于正常视网膜（P<0.05）,同时从V-BDNF治疗组P波振幅值明显大于对照组（P<0.05）,说明基因治疗不仅使更多的RGC被保护而存活,而且存活的RGC能够发挥其正常生理功能。视网膜电图检测分析：1个月正常对照组OPs振幅与AAV-EGFP对照组比较就有显著性差异（P<0.05）,3个月正常对照组OPs振幅与AAV-EGFP对照组比较有非常显著性差异（P<0.01）。且AAV-BDNF治疗组与AAV-EGFP对照组相比,OPs波振幅值明显大于AAV-EGFP对照组（P<0.05）。AAV-EGFP对照组的视网膜电图b波波幅在糖尿病6个月时与正常对照组比较有显著性差异（P<0.05）,9个月正常对照组b波振幅与AAV-EGFP对照组比较有非常显著性差异（P<0.01）,然而AAV-BDNF治疗组在治疗6个月及9个月时b波幅值明显大于AAV-EGFP对照组。说明基因治疗对糖尿病模型大鼠视网膜功能恢复有一定帮助。结论：1.构建的rAAV-BDNF和rAAV-EGFP能高效转染视网膜组织,并在视网膜上成功表达BDNF蛋白和绿色荧光蛋白。2.治疗组中被重组AAV病毒载体转染的表达BDNF的RGC数量明显多于对照组中表达EGFP的细胞数量,说明了良好的治疗效果。同时也可以保护未被AAV-BDNF转染的一部分视网膜神经节细胞。3.糖尿病大鼠模型中给予重组AAV病毒载体介导的BDNF基因治疗,对于视网膜神经节细胞数量以及功都能产生良好的治疗效果。
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标签：糖尿病视网膜病变论文; 基因治疗论文; 腺相关病毒载体论文; 脑源性神经营养因子论文;