疟原虫裂殖子顶端膜抗原1（AMA-1）免疫保护功能域的分析

论文摘要

疟疾目前仍然是严重威胁人类健康的热带传染病。由于疟原虫抗药性以及蚊媒抗杀虫剂的抗性产生并广泛传播,使传统的疟疾防治方法面临严重困难。研制有效的疟疾疫苗被认为是疟疾防治的重要途径。 疟原虫（Plasmodium）裂殖子顶端膜抗原1（apical membrane antigen 1,AMA-1）是一个重要的疟疾疫苗候选抗原,它存在于所有已经验证的疟原虫种中,虽然对AMA-1的功能尚不清楚,但目前认为该蛋白在疟原虫入侵宿主细胞的过程中发挥重要作用,对疟原虫生长可能起着必不可少的作用。AMA-1的分子结构在种间相当保守,其胞外区含有16个半胱氨酸,形成以二硫键结构为基础的稳定的天然构象,根据二硫键的位置关系推测,可分为3个二硫键依赖的区域（Domain Ⅰ、Domain Ⅱ和DomainⅢ）,分别含有3对、2对和3对二硫键。 以往研究表明AMA-1具有良好的免疫原性和保护性,但是对该分子中的保护性免疫功能域尚缺乏明确的分析和鉴定。本研究以伯氏疟原虫（Plasmodium berghei,Pb）AMA-1作为研究对象,利用伯氏疟原虫小鼠动物模型进行PbAMA-1分子保护性免疫功能区域的鉴定,其结果可以指导含AMA-1区域或表位的疫苗的构建。 首先,我们对我室保存的伯氏疟原虫虫株的AMA-1基因进行了测序。在PbAMA-1基因内部设计两对引物,用PCR法扩增得到两个片段,其长度分别为1100bp和900bp,两个片段约有200bp的重叠区,对两个片段进行全序列测序,获得完整的PbAMA-1胞外区的基因序列。依据测序所得的PbAMA-1 DNA序列,推导其氨基酸序列。根据文献报道和二硫键的位置,将PbAMA-1胞外区分为三个彼此之间重叠的基因片段,分别命名为DⅠ、DⅡ和DⅢ。在三个片段的重叠区利用同义密码子替换引入Cla I和Pac I两个限制性内切酶识别位点,用于基因片段间的拼接。采用毕氏酵母密码子使用频率重新设计DⅠ、DⅡ和DⅢ的核苷酸序列。在该基因中发现7个潜在的糖基化位点（Asn-X-Ser/Thr）,通过Asn→Gln氨基酸突变消除这些糖基化位点。为便于该蛋白的纯化,在基因的3’端添加6个编码组氨酸的序列（6×His tag）。序列优化后PbAMA-1基因的A+T的含量由原来的69.6%降到了63.0%。

论文目录

• 摘要
• 前言
• 材料与方法
• 主要试剂和缓冲液的配制
• 结果
• 一、PbAMA-1基因序列的测定、设计与优化
• 二、PbAMA-1各片段的克隆
• 三、PbAMA-1各表达片段的诱导表达与纯化
• 四、PbAMA-1各表达片段的免疫原性与保护性分析
• 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 综述