基因定点突变提高人醇脱氢酶ADH2蛋白酶活性的研究

论文摘要

醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase ADH）是一种含锌金属酶。其最重要的作用是催化乙醇代谢的初始反应,因此关于醇脱氢酶活性的研究在防止乙醇引起的肝损伤方面具有重要意义,把ADH应用在研制开发解酒护肝药物方面有很大的潜力。随着基因定点突变技术的迅速发展,人们通过定点突变可以达到改造蛋白质结构和功能的目的。ADH2活性中心附近残基的存在限制了乙醇脱氢酶的活性中心区,因此这些位点的替代会扩大该口袋并改变其底物特异性及亲和力,使酶活性得到显著提高。采用大引物突变法改变ADH2基因,设计3条引物,一条突变引物,另外两条引物位于突变引物的两侧,并带上合适的酶切位点,以供突变片段构建完成以后可以克隆至合适的载体。然后以突变引物与其附近的反向引物一起扩增带突变位点的片段,再以此PCR产物片段为引物与剩下的另一条引物一起扩增,成功实现定点突变,将其94位由苯丙氨酸突变为丙氨酸,将371位由苏氨酸突变为半胱氨酸。以pTYB11为载体,利用EcoR I和Xho I酶切位点构建了ADH2突变基因的原核表达载体,将其导入宿主菌ER2566中获得表达。最佳诱导时间为4 h,最佳诱导温度为16℃,最佳IPTG浓度为0.3 mmol·L-1。突变ADH2的蛋白表达量占总蛋白的15.85﹪。利用Chitin纯化柱纯化宿主菌ER2566中表达的突变的ADH2,获得了分子量约为40 KD的目的蛋白。利用考马斯亮兰法测定蛋白浓度,确定纯化重组突变酶ADH2的蛋白质浓度范围是0.25 mg·mL-1～0.33 mg·mL-1。在25℃,pH7.5的100 mmol·L-1磷酸钠溶液中测定突变重组酶的A340nm,以酵母醇脱氢酶为标准蛋白,计算突变重组酶制剂的酶活力,测得定点突变后ADH2的比活力为8.9 U·mg-1,实现了其酶活力的显著提高。本试验成功地对人醇脱氢酶ADH2实现了点突变,使其活性得到了显著提高。为进一步研究它的生物学功能提供了良好的条件,并为研制与开发新型的解酒护肝产品奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 醇脱氢酶的研究现状
• 1.1.1 ADH 的分子结构
• 1.1.2 ADH 的酶促反应作用机理
• 1.1.3 人类ADH 的基因多态性
• 1.1.4 不同来源的ADH 的基本研究
• 1.1.5 ADH 的应用
• 1.2 基因定点突变技术的研究进展
• 1.2.1 基因定点突变技术的主要特征
• 1.2.2 寡核苷酸引物指导的定点诱变
• 1.2.3 盒式诱变
• 1.2.4 PCR 介导的定点诱变
• 1.3 研究目的与意义
• 2 材料
• 2.1 实验材料
• 2.2 克隆和表达载体
• 2.3 酶和生化试剂
• 2.4 引物
• 2.5 主要仪器和设备
• 3 方法
• 3.1 人醇脱氢酶ADH2 的定点突变
• 3.1.1 对人醇脱氢酶ADH2 质粒进行双酶切鉴定
• 3.1.2 ADH2 点突变第一轮PCR 反应
• 3.1.3 第一轮PCR 产物的纯化
• 3.1.4 ADH2 点突变第二轮PCR 反应
• 3.1.5 突变ADH2 PCR 产物的纯化
• 3.1.6 PCR 纯化产物与克隆载体的连接
• 3.1.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.1.8 重组克隆载体的转化
• 3.1.9 阳性克隆的筛选
• 3.1.10 阳性重组质粒的鉴定
• 3.1.11 定点突变后的ADH2 基因cDNA 序列测定与结果分析
• 3.2 突变ADH2 基因全长CDNA 在大肠杆菌中的表达
• 3.2.1 带有相匹配粘性末端ADH2 基因全长cDNA 与原核载体的制备
• 3.2.2 ADH2 基因成熟多肽cDNA 与原核表达载体的连接
• 3.2.3 重组原核表达载体的转化
• 3.2.4 阳性重组质粒的筛选与鉴定
• 3.2.5 阳性重组质粒转化表达宿主菌及鉴定
• 3.2.6 重组质粒的诱导
• 3.2.7 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 3.3 目的蛋白的纯化
• 3.3.1 Chitin 纯化柱的平衡
• 3.3.2 包涵体的溶解
• 3.3.3 融合蛋白的复性
• 3.3.4 纯化目的蛋白
• 3.3.5 Chitin 树脂的再生与保存
• 3.3.6 纯化蛋白质含量的测定
• 3.3.7 突变ADH2 重组酶活力检测
• 4 实验结果
• 4.1 对人醇脱氢酶ADH2 的定点突变
• 4.1.1 对人醇脱氢酶ADH2 质粒进行双酶切鉴定
• 4.1.2 对ADH2 进行定点突变的第一轮PCR 反应
• 4.1.3 对ADH2 进行定点突变的第二轮PCR 反应
• 4.1.4 突变重组克隆质粒pGEM-T-ADH2 的鉴定
• 4.1.5 突变ADH2 基因cDNA 序列测定与结果分析
• 4.2 ADH2 突变基因全长CDNA 在大肠杆菌中的表达
• 4.2.1 ADH2 突变基因全长cDNA 原核表达载体的构建
• 4.2.2 ADH2 突变基因全长cDNA 在大肠杆菌中的表达
• 4.3 目的蛋白的纯化
• 4.3.1 目的蛋白的纯化
• 4.3.2 纯化重组酶的蛋白质浓度
• 4.3.3 重组酶活性检测
• 5 讨论
• 5.1 ADH2 空间结构分析
• 5.2 定点突变方法的选择
• 5.3 目的蛋白的高效表达
• 5.4 包涵体的溶解及融合蛋白的复性
• 5.5 重组酶的酶学研究及应用前景
• 6 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文