丹参素转化酶的分离纯化及酶性质研究

论文摘要

本论文以微生物所产丹参素转化酶为研究对象,主要研究了微生物发酵粗酶液的酶反应条件、酶的分离纯化、提纯酶的性质及酶反应特性。通过实验,确定了粗酶液的酶反应条件为:最适底物浓度为2%;最适pH为5.0;最适反应时间为8h;最适反应温度为45℃。用DEAE-celluloseDE52阴离子交换柱对上述粗酶液进行分离纯化,提纯酶用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳检测纯化度,得到了单带,并由SDS-PAGE确定提纯酶的分子量为60BKDa。对提纯酶的酶性质研究可知,丹参素转化酶的最适pH值为5.0;最适温度45℃;最适反应时间为8h;pH范围在3～7时酶活力稳定;温度范围在25℃～60℃时酶活力稳定;金属离子对酶活力的影响为:Fe3+、Cu2+、Ca2+对酶活力有抑制作用;Mg2+对酶活力有激活作用;Zn2+、K+、Na+对酶活力影响不大;酶反应的Vmax=7.246mmlo/L·h,Km=68.03mmol/L。提纯酶的酶反应特性为,此酶具有pNP-β-D-Gal、pNPR、pNPP酶活力;对pNP-a-D-GLc具有弱的水解活力;不具有pNP-β-D-GLc、pNP-α-D-Gal及α-淀粉酶活力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 中药中天然产物化学的研究
• 1.1.1 中药化学与天然产物开发
• 1.1.2 基于生物技术的天然产物化学研究
• 1.2 丹参的植物形态及生长习性,分类,药理学研究
• 1.2.2 丹参的分类
• 1.2.3 丹参的药理学研究
• 1.3 丹参中的化学成分及主要成分的药理作用
• 1.3.1 丹参中主要化学成分的研究
• 1.3.1.1 丹参素的化学结构
• 1.3.1.2 其他水溶性成分的化学结构
• 1.3.2 丹参素的药理作用
• 1.4 丹参素生物转化的研究进展
• 1.5 本论文主要研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料、试剂与设备
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂与材料
• 2.1.4 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 微生物的发酵培养
• 2.2.2 粗酶液的提取
• 2.2.3 酶活力测定方法
• 2.2.4 薄层层析法
• 2.2.5 粗酶液酶反应条件的研究
• 2.2.6 提取酶液蛋白含量的测定及蛋白浓度与酶活力关系的研究
• 2.2.6.1 G-250考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
• 2.2.6.2 粗酶液浓度的变化与酶活力之间的关系
• 2.2.7 用DEAE-cellulose DE52阴离子交换层析分离纯化丹参素转化酶
• 2.2.7.1 DEAE—cellulose DE52阴离子交换柱的处理
• 2.2.7.2 DEAE柱的上样分离
• 2.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化度及计算丹参素转化酶的分子量
• 2.2.8.1 溶液的配制
• 2.2.8.2 胶的制备
• 2.2.8.3 样品处理
• 2.2.8.4 实验过程
• 2.2.9 提纯酶的酶性质研究
• 2.2.9.1 最适pH值的研究
• 2.2.9.2 pH稳定性的研究
• 2.2.9.3 最适反应温度的研究
• 2.2.9.4 温度稳定性的研究
• 2.2.9.5 金属离子对酶活影响的研究
• 2.2.9.6 丹参素转化酶的米氏常数
• 2.2.10 丹参素转化酶酶特性的研究
• 2.2.10.1 pNP系列酶活力研究
• 2.2.10.2 α-淀粉酶酶活力研究
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 粗酶液的酶反应条件的研究
• 3.1.1 酶反应最适底物浓度的确定
• 3.1.2 酶反应最适pH的确定
• 3.1.3 酶反应最适温度的确定
• 3.1.4 酶反应最佳反应时间的确定
• 3.2 粗酶液蛋白含量的研究
• 3.2.1 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白含量
• 3.2.2 粗酶液浓度变化与酶活的关系
• 3.3 DEAE-cellulose DE52阴离子交换柱分离纯化丹参素转化酶
• 3.3.1 上柱前酶活的测定
• 3.3.2 DEAE阴离子交换柱的上样分离
• 3.3.3 峰值管酶液酶活力检测
• 3.3.4 SDS-PAGE检测丹参素转化酶纯化度并计算提纯酶的分子量
• 3.3.4.1 SDS-PAGE检测丹参素转化酶纯化度
• 3.3.4.2 根据SDS-PAGE电泳图计算提纯酶的分子量
• 3.4 提纯酶液的酶性质研究
• 3.4.1 提纯酶液最适pH值的研究
• 3.4.2 pH稳定性的研究
• 3.4.3 最适反应温度的研究
• 3.4.4 温度稳定性的研究
• 3.4.5 金属离子对酶活力影响的研究
• 3.4.6 丹参素转化酶米氏常数的研究
• 3.5 酶反应特异性的研究
• 3.5.1 pNP系列酶活力的测定
• 3.5.2 α-淀粉酶活力测定
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢