甲醛胁迫下枯草芽孢杆菌孢子萌发拉曼光谱特性研究

论文摘要

芽孢杆菌休眠孢子的萌发是孢子恢复到营养生长的第一个决定性步骤。孢子被营养性萌发剂和各种非营养信号诱导而萌发恢复到营养细胞状态。芽孢萌发后就丧失了对外界胁迫的抵抗力。2,6-二羧酸吡啶（DPA-Ca2+）是细菌芽孢特有的成分,其在芽孢抗性和稳定性方面有很重要的作用,随着DPA-Ca2+释放,不含DPA-Ca2+的芽孢就失去对外界胁迫的抗性。研究芽孢DPA-Ca2+释放行为及其外界胁迫下芽孢成分变化,对于深入了解细菌芽孢抗性机制有重要意义。运用激光镊子拉曼光谱技术（LTRS）研究了单个枯草杆菌芽孢响应甲醛胁迫过程中动态的变化过程以及DPA-Ca2+释放方式,并结合多元统计分析方法统计分析芽孢用甲醛处理前后的成分差异。结果表明：甲醛胁迫下芽孢耐受甲醛能力比萌发后DPA-Ca2（?）完全释放的芽孢强500多倍；与萌发剂诱导或氯气、高温湿热胁迫不同,甲醛的胁迫不会引起芽孢DPA-Ca2+的释放,甲醛是直接穿透细菌孢子多层屏障进到孢子内部作用于孢子的蛋白质和DNA。多元统计方法分析1000mM甲醛胁迫芽孢后芽孢内生物大分子的光谱数据显示,导致芽孢致死原因是甲醛损伤核酸的嘌呤碱、G-C碱基对,破坏蛋白质的C-C主链,对膜脂也有一定的伤害。1.5mM甲醛胁迫萌发后芽孢（germinated spores）的致死原因除了破坏蛋白质的C-C主链以外,也伤害其侧链；对腺嘌呤和膜脂类有轻微的损伤。958cm-1的载荷绝对值最大,提示甲醛对萌发后芽孢伤害最大是它的蛋白质。氯气和湿热胁迫枯草芽孢杆菌孢子,其核心DPA-Ca2+（?）释放与孢子致死并不是同步的,孢子被胁迫致死时孢子内依然还保留有DPA-Ca2+,氯气和湿热处理孢子都能使核心DPA-Ca2+（?）释放,此过程非常迅速,一般在1-2分钟释放完,DPA-Ca2+完全释放后跟随着1655cm-1谱峰漂移到1665cm-1蛋白质主链有序结构（α-螺旋）减少,无规则卷曲增加,导致蛋白质分子空间结构发生变化。主成分分析（PCA）分析结果表明：氯气主要破坏芽孢的内膜,引起DPA-Ca2+释放,氯气进到孢子内部破坏孢子蛋白质的C-C主链,损伤核酸,导致芽孢致死；高温损伤了酪氨酸的对羟苯基环、色氨酸的吲哚环,蛋白质的侧链基团受到破坏甚至破裂,同时胁迫会引起脯氨酸的积累,表明湿热胁迫主要损伤其蛋白质或使酶失活。枯草芽孢杆菌是可以同化甲醛的非甲基营养菌,其营养细胞可以通过核酮糖单磷酸途径（RuMP）同化甲醛为自身细胞的组分。为了探究枯草芽孢杆菌萌发后孢子（germinated spores）响应甲醛胁迫过程的生理反应及其耐受甲醛机理,利用激光镊子拉曼光谱系统（LTRS）研究不同浓度甲醛胁迫萌发后孢子（g. spore） 2 h的响应过程。结果显示,营养细胞和萌发后的孢子（g. spores）都具有耐受甲醛的能力,但营养细胞的耐受能力远强于萌发后的孢子（g. spores）,与营养细胞含有相同的遗传物质和功能性蛋白的萌发后孢子（g. spores）不能吸收、代谢甲醛。萌发后孢子（g. spores）响应甲醛胁迫的拉曼光谱特征峰的走势显示,0.4 mmol/L甲醛胁迫萌发后的孢子（g. spore）,在0-1.5 h范围内代表蛋白质、脂类和核酸的特征峰变化峰强增加的幅度大于孢子在不含甲醛的培养基中变化趋势,这种变化趋势反映了萌发后孢子（g. spores）在受到甲醛胁迫初期做出较强烈的响应模式,很多基因的表达水平上升,细胞内代谢水平增加,大分子物质积累也跟着增加,在第1.5 h后体内各组分下降,表明细胞受到轻度的伤害；0.8 mmol/L甲醛胁迫萌发后孢子,细胞体内成分下降的临界点提前到了第1.0 h,归属核酸的谱峰一开始就慢慢下降,显示整个过程DNA不能进行复制,归属膜磷脂和蛋白质的C-S伸缩振动的谱峰在0.5 h后即呈明显下降趋势,提示0.8 mmol/L甲醛胁迫细胞后,甲醛导致膜脂碳氢链断裂；1.0 mmol/L甲醛胁迫下,谱峰下降的临界时间点是第0.5 h,表明细胞对该浓度甲醛产生了剧烈的胁迫效应,在0.5 h后就导致生物大分子含量严重下降,最终使细胞受到的伤害逐步加重。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 芽孢杆菌孢子萌发机理的研究
• 1.1.1 孢子萌发的概况
• 1.1.2 萌发剂触发孢子萌发的早期事件——信号转导过程
• 1.1.3 芽孢营养性萌发剂与特殊受体的相互作用
• 1.1.4 芽孢萌发过程中的离子通道
• 1.1.5 芽孢萌发过程中皮层溶解酶的作用
• 1.1.6 芽孢的非营养性萌发及其途径
• 1.2 微生物代谢甲醛的机制
• 1.2.1 甲醛的代谢途径
• 1.2.2 RuMP途径的生理作用
• 1.3 激光光镊拉曼光谱
• 1.3.1 激光光镊拉曼光谱系统的发展
• 1.3.2 激光镊子拉曼光谱的基本原理和系统设置
• 1.3.3 激光光镊的应用
• 1.3.4 拉曼镊子技术的优点和发展前景
• 1.4 本研究的主要内容和意义
• 第二章 细菌芽孢响应甲醛胁迫的单细胞拉曼光谱研究
• 前言
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 细菌芽孢的培养和制备
• 2.1.3 germinated spores的制备
• 2.1.4 细菌芽孢以及germinated spores耐受甲醛能力（存活率）的测定
• 2.1.5 漂白水溶液中有效氯含量的测定
• 2.1.6 细菌孢子以及outgrowth细胞拉曼光谱的测定
• 2.1.7 数据处理
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 细菌孢子以及germinated spores耐受甲醛能力的比较
• 2.2.2 细菌孢子以及germinated spores的拉曼光谱
• 2（?）的释放行为'>2.2.3 单个细菌孢子在甲醛、氯气、湿热、萌发剂处理后DPA-Ca^2（?）的释放行为
• 2.2.4 细菌孢子甲醛胁迫前后成分差异性的PCA比较分析
• 2.2.5 萌发后细菌孢子甲醛胁迫前后成分差异性的PCA比较分析
• 2.3 讨论
• 第三章 拉曼光镊研究细菌芽孢响应湿热、氯气胁迫的致死机制
• 前言
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 枯草杆菌孢子对漂白水和湿热耐受能力的测定
• 3.2.2 经漂白水处理的群体孢子拉曼平均光谱以及单个孢子在不同时间点的特征光谱
• 3.2.3 单个和群体孢子响应100℃湿热的拉曼光谱特性
• 3.2.4 牛血清蛋白（BSA）热变性的拉曼光谱特性
• 3.2.5 枯草芽孢杆菌孢子氯气胁迫后光谱变化的PCA比较分析
• 3.2.6 枯草芽孢杆菌孢子100℃水胁迫后光谱变化的PCA比较分析
• 3.3. 讨论
• 3.4 结论
• 第四章 枯草芽孢杆菌萌发后孢子响应甲醛胁迫过程的拉曼光谱研究
• 前言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 枯草芽孢杆菌孢子的培养,制备
• 4.1.2 萌发后孢子（g.spores）的制备
• 4.1.3 萌发后孢子（g.spores）吸收和耐受甲醛能力的测定
• 4.1.4 萌发后孢子（g.spores）拉曼光谱的测定
• 4.1.5 数据处理
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 枯草芽孢杆菌萌发后孢子（g.spores）耐受甲醛能力以及代谢甲醛能力
• 4.2.2 甲醛胁迫萌发后孢子（g.spores）生长过程的拉曼光谱特征及峰强度的变化
• 4.3 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录