芸苔属蔬菜小孢子培养及自交不亲和性的分子鉴定

论文摘要

芸苔属蔬菜是一类重要的蔬菜作物，在我国种质资源丰富，大多数芸苔属蔬菜属异花授粉作物，杂种优势明显。使用常规方法，选育一个纯合的自交系或自交不亲和系一般需要5-8年时间。而运用小孢子培养技术在1-2年就可以获得大量纯合的双单倍体植株。目前，大部分芸苔属蔬菜均是利用自交不亲和系来生产F1代杂交种。自交不亲和性广泛存在，但自交不亲和性强度及S单元型类型鉴定相当繁琐。本研究的目的主要是想结合小孢子培养与自交不亲和性的分子鉴定，建立一套快速而高效的育种体系。本研究选取大白菜、红菜苔和甘蓝3种芸苔属蔬菜，研究了影响小孢子培养和植株再生过程中的诸多因素，获得了大量胚状体和再生植株。并对其后代植株的倍性，遗传多样性，白交不亲和性的强度、分子遗传及表达进行了分析。最后，调查了目前我国主要的几种芸苔属蔬菜中自交不亲和S单元型的类型。主要结果如下： 1．小孢子培养因素研究对小孢子培养过程中基因型、小孢子发育时期、活性炭、小孢子密度、蔗糖浓度、高温预处理和大量元素浓度等7种因素进行了研究。在73.3％的大白菜，76.9％的红菜苔，50％的甘蓝基因型中获得了小孢子胚状体。选择单核靠边期比率为50-70％的小孢子，将密度设为1.5-2个花蕾／ml，添加0.3mg／ml活性炭有利于大白菜和红菜苔小孢子胚胎发生。而选择含10-30％的双核期小孢子，将密度设为1.5个花蕾／皿，添加0.1mg／ml有利于甘蓝小孢子胚胎发生。蔗糖浓度为13％时，在3种芸苔属蔬菜中均获得了较好的结果。另外，在32℃热激处理18h，将大量元素的浓度减少一半有利于大多数红菜苔基因型的小孢子胚胎发生。 2．植株再生因素研究对胚状体再生过程中琼脂浓度，胚龄，低温预处理和培养基类型等4种因素进行了研究。在10个大白菜，9个红菜苔和2个甘蓝基因型中获得了大量再生植株。结果表明，琼脂浓度为1.2％，在4℃下处理10d，均能显著促进3种蔬菜的植株再生；大白菜和红菜苔最适胚龄为20-29d，而甘蓝为30d以上；B5和MS两种培养基对植株的再生没有明显的影响。 3．DH植株倍性鉴定对3种芸苔属蔬菜获得的小孢子植株的倍性鉴定后，发现大白菜自然加倍率不同品种间变化较大，但都在50％以上，红菜苔的自然加倍率相当高，达到70％以上，而甘蓝的自然加倍率较低，在30％左右。 4．DH群体内自交不亲和性的分子鉴定与遗传利用class Ⅰ和class Ⅱ的SLG和SRK特异引物，对3种芸苔属蔬菜7个DH群

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摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1 课题的提出

2 研究进展

2.1 芸苔属蔬菜小孢子培养研究进展

2.1.1 小孢子培养技术的应用研究

2.1.2 小孢子培养方法和影响因素研究

2.1.3 影响小孢子植株再生因素研究

2.1.4 单倍体花粉植株倍性研究

2.1.5 小孢子发生的形态学观察

2.1.6 小孢子培养及应用存在的问题

2.2 自交不亲和性的研究进展

2.2.1 孢子体自交不亲和遗传机理的研究进展

2.2.2 孢子体自交不亲和基因的类型

2.2.3 孢子体自交不亲和性测定方法的研究进展

3 研究的目的和意义

第二章芸苔属蔬菜小孢子培养,再生及倍性分析

1 前言

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 培养基

2.3 小孢子培养因素研究

2.3.1 花蕾的选择

2.3.2 小孢子的分离与培养

2.3.3 提高小孢子胚状体诱导频率的研究

2.4 小孢子胚胎发育过程的细胞学观察

2.5 植株再生因素研究

2.6 植株的倍性测定及加倍处理

2.6.1 植株倍性鉴定

2.6.2 植株移栽与加倍处理

2.7 数据统计分析

3 结果与分析

3.1 不同因素对小孢子诱导效果比较

3.1.1 基因型对小孢子胚胎发生的影响

3.1.2 小孢子发育时期对胚胎发生的影响

3.1.3 活性炭对小孢子胚胎发生的影响

3.1.4 密度对小孢子胚胎发生的影响

3.1.5 蔗糖浓度对小孢子发生的影响

3.1.6 高温预处理对红菜苔出胚的影响

3.1.7 大量元素浓度对红菜苔出胚的影响

3.2 小孢子培养过程中胚胎发生的细胞学观察

3.3 影响胚状体再生成苗的因素

3.3.1 琼脂浓度

3.3.2 胚龄

3.3.3 低温

3.3.4 培养基的类型

3.4 倍性测定与加倍

3.4.1 倍性测定

3.4.2 加倍与移栽

4 讨论

4.1 小孢子培养因素的影响

4.2 胚状体再生因素的影响

4.3 染色体加倍

第三章 DH群体内自交不亲和性强度的分子鉴定、遗传与表达分析

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 自交不亲和性的田间鉴定

2.3 PCR-RFLP分析

2.3.1 SLG和SRK的扩增

2.3.2 PCR产物酶切

2.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银盐染色

2.4 自交不亲和基因的表达分析

3 结果与分析

3.1 自交不亲和基因的扩增

3.2 自交不亲和性强度的鉴定

3.3 自交不亲和基因的分子遗传

3.4 芸苔属蔬菜自交不亲和基因的表达分析

4 讨论

第四章大白菜DH群体遗传变异分析与杂交组合配置

1 前言

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 品质测定的方法

2.3 RAPD分析

2.4 数据分析

2.4.1 遗传多样性参数计算

2.4.2 聚类分析

2.4.3 农艺、品质和RAPD三种标记的相关性比较

2.4.4 杂交组合的选配

3 结果与分析

3.1 农艺性状与品质性状的多样性分析

3.1.1 农艺性状的多样性分析

3.1.2 品质性状的多样性分析

3.2 大白菜DH群体农艺性状与品质性状的聚类分析

3.3 利用RAPD对DH群体的多样性分析

3.4 农艺、品质和分子三种标记的相关性比较

3.5 杂交组合的配置

4 讨论

第五章芸苔属蔬菜自交不亲和S单元型的鉴定

1 前言

2 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.2 SLG和SRK基因的PCR扩增

2.3 PCR产物酶切

2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银盐染色

2.5 自交不亲和基因克隆与测序

3 结果与分析

3.1 自交不亲和基因S单元型的扩增和鉴定效率比较

3.2 S单元型的多样性分布

3.3 自交不亲和基因的克隆与序列分析

4 讨论

第六章总结与讨论

参考文献

附录

附录一：植物DNA的小量法提取程序：

附录二：质粒的小量提取方法

附录三：Trizol一步法提取植物总RNA方法

附录四：Southern Blot程序

附录五:Northern Blot 程序

附录六：登记基因信息

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