禽流感DNA疫苗的体内分布与制备工艺研究

论文摘要

本课题在已有的禽流感DNA疫苗pCAGGoptiH5的基础上,以中试和新药申报为目的,对该疫苗的体内分布和制备工艺进行了较为系统的研究。选择21日龄SPF鸡以10ug/只的剂量,肌肉注射禽流感DNA疫苗pCAGGoptiH5,在接种后的1h、3h、1d、3d、7d、15d、30d、50d、80d、120d、150d、200d、280d对SPF鸡血、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑及注射部肌肉进行PCR检测。结果核酸疫苗在免疫后1小时,就已分布到各目的组织中,在血中可存留15天,而在注射部肌肉中可存留达280天。此外,已有的试验证明了禽流感DNA疫苗pCAGGoptiH5对SPF鸡可提供完全保护。而为了满足中试的需求,本试验又对DNA疫苗的制备工艺进行了研究。确立了以流加补料和变温法对宿主菌进行发酵罐发酵、碱裂解法裂解细胞、中空纤维切向流微滤+超滤法进行过滤浓缩、阴离子交换色谱进行纯化的质粒纯化工艺,在没有标准可参照的情况下,本试验对纯化所得禽流感DNA疫苗pCAGGoptiH5从四个方面进行了鉴定:纯度、酶切鉴定、PCR鉴定、免疫活性鉴定,结果显示本工艺纯化所得质粒稳定且免疫活性高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 禽流感病毒及其研究进展
• 1.1 AIV 的致病性及危害
• 1.2 禽流感的公共卫生意义
• 1.3 病原
• 1.4 禽流感疫苗研究进展
• 2 核酸疫苗研究进展
• 2.1 核酸疫苗的产生背景
• 2.2 核酸疫苗的免疫机理
• 2.3 DNA 疫苗的优化策略
• 2.4 DNA 疫苗最新进展
• 2.5 核酸疫苗的发展前景
• 3 本次研究的目的和意义
• 实验一 疫苗质粒在SPF 鸡体内的分布研究
• 1 材料与方法
• 1.1 SPF 鸡
• 1.2 菌种及质粒
• 1.3 引物
• 1.4 相关试剂
• 1.5 免疫及组织器官的采集
• 1.6 PCR 检测
• 1.7 PCR 产物测序
• 2 结果检测
• 2.1 PCR 结果分析
• 2.2 DNA 测序结果分析
• 3 结果
• 4 讨论
• 4.1 核酸疫苗在动物体内的传播途径
• 4.2 核酸疫苗与动物基因组整合的问题
• 实验二 DNA 疫苗制备工艺研究
• 一 工程菌发酵
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 菌种及质粒
• 1.3 培养基
• 2 方法
• 2.1 第一级发酵
• 2.2 第二级发酵
• 2.3 菌体浓度检测
• 2.4 质粒得率的检测
• 3 结果
• 3.1 不同发酵条件下工程菌的生长曲线
• 3.2 对发酵后质粒得率的检测结果
• 二 核酸疫苗纯化及鉴定
• 1 细胞裂解与质粒浓缩
• 1.1 试剂、溶液和仪器
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 2 质粒纯化
• 2.1 试剂、溶液和仪器
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 3 纯化质粒DNA 的鉴定
• 3.1 主要试剂和材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 4 讨论
• 4.1 宿主菌高密度发酵
• 4.2 细胞裂解和质粒DNA 浓缩
• 4.3 阴离子交换色谱纯化质粒DNA
• 4.4 质粒DNA 的鉴定
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介